時間：2022-08-20 05:02:56
緒論：在尋找寫作靈感嗎？愛發(fā)表網(wǎng)為您精選了8篇行政擔保書，愿這些內(nèi)容能夠啟迪您的思維，激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，歡迎您的閱讀與分享！
原發(fā)性血小板增多癥是多能造血干細胞的克隆性疾病，是指血小板計數(shù)多在1000～3000×109/L的一種骨髓增殖性疾病，病變主要表現(xiàn)在巨核細胞.血小板系統(tǒng)，出血和血栓形成是發(fā)病和死亡的主要原因[1]。我科2008至今應用美國百特公司生產(chǎn)的CS3000血細胞分離機為65例原發(fā)性血小板增多癥病人行血小板分離術(shù)，迅速減少血小板數(shù)量，改善癥狀取得了較好的療效。
1 臨床資料
65例中男38例，女27例，年齡28-91歲，均行血象，骨髓象檢查, 均符合國內(nèi)的診斷標準[2]，患者均有不同程度的高粘滯血癥，神智清楚。
2 方法
應用美國百特公司生產(chǎn)的CS3000血細胞分離機及一次性消耗管道，選擇血細胞單采程序，ACD抗凝劑，專用生理鹽水，雙針循環(huán)進行采集，全血處理血量5000Ml,全血流速30-50ml，ACD抗凝劑與全血比例為11∶1。
3 護理
3.1 單采前護理。
3.1.1 物品準備：CS3000血細胞分離機及一次性消耗管道，16號專用針頭，ACD抗凝劑，專用生理鹽水，10%葡萄糖酸鈣，地塞米松，氧氣，心電監(jiān)護儀，及各種急救藥品和器械。
3.1.2 環(huán)境準備：血細胞分離室使用前后均予紫外線照射30分鐘，地面予500mg/L有效氯濕拖。
3.1.3 病人準備：做好心理護理，向病人介紹血小板分離術(shù)的治療作用極其重要意義及單采過程中的注意事項，消除顧慮，觀察病人的血管情況，指導病人保護好淺表大靜脈，單采當天清淡飲食，適當多飲水2000ml/日。術(shù)前10分鐘予10%葡萄糖酸鈣20mL口服st預防枸櫞酸鈉反應。
3.2 單采術(shù)中護理
3.2.1 安裝管道，連接ACD抗凝劑，專用生理鹽水選擇血小板單采程序，機器初始化備用，
3.2.2 置病人平臥位，安裝好心電監(jiān)護儀，氧氣吸入3升/分，無菌操作原則行肘部大靜脈穿刺，穿刺成功予妥善固定，指導病人雙肘自然升直，勿亂動，必要時使用約束帶。予地塞米松5mg iv st,單采過程中全血流速30-50ml,為保證病人血流暢通，足夠血流量。予心理支持，穩(wěn)定病人的情緒，避免血管收縮，并指導病人進血管側(cè)肢體做有節(jié)奏的握拳和松拳動作、必要時予穿刺點上方綁加壓袖帶加壓以保證血流量,單采過程中應密切觀察病人的病情變化，如胸悶氣急，出冷汗，血壓下降等低血容量癥狀及手足麻木等低血鈣癥狀，如有應予相應處理，本組病例無1例發(fā)生低血壓癥狀，有9例發(fā)生輕度手足發(fā)麻的低血鈣癥狀，予10%葡萄糖酸鈣口服后緩解。
3.2.3 單采術(shù)后護理:治療結(jié)束，予拔針后局部穿刺點加壓包扎60分鐘，肢體切勿用力支撐，以防血腫發(fā)生，本組病例無1例發(fā)生血腫。做好單采記錄，觀察病人的生命體征，病人的生命體征平穩(wěn)，用平車護送回病房，繼續(xù)平臥4-6小時，指導病人多飲水，與床位醫(yī)生、責任護士嚴格交班，做到三班交接?；匮毎蛛x室撤去管道，保養(yǎng)機器。
4 體會
原發(fā)性血小板增多癥是一種骨髓增殖性疾病，患者出現(xiàn)顯著性持續(xù)血小板增多及功能障礙，并伴有紅細胞和白細胞增多。紅細胞壓積、血小板計數(shù)及血小板功能是影響血液流變學的主要因素[3,4],血小板板單采術(shù)能使循環(huán)中血小板在短期內(nèi)下降，已用于治療原發(fā)性血小板增多癥患者。在血小板單采術(shù)中，護理至關(guān)重要，術(shù)前做好心理護理，指導病人多飲水，能降低血液粘稠度，避免血管收縮，保證靜脈穿刺后血流通暢，機器正常運行，術(shù)中密切觀察生命體征變化，術(shù)后的健康指導，本組病人經(jīng)我們精心護理，無一例發(fā)生嚴重不良反應，療效滿意。
參考文獻
[1] Barbui T,Finazzi G. Management of essential thrombocythemi[J].Clin Rev Oncol/Hematiology, 1999,29;257
[2] 張之南,血液病診斷及療效標準[M]1 第2版，北京：科學技術(shù)出版社，1998,289;290
真性紅細胞增多癥（PV）是指外周血液中紅細胞數(shù)超過正常值，HB、HCT亦相應增高的一種原因不明慢性進行性骨髓造血活性普遍亢進的疾病，屬于骨髓組織異常增生的腫瘤性疾病。臨床表現(xiàn)以皮膚紅紫和血管及神經(jīng)系統(tǒng)為特征[1]。目前在治療上無特效，其治療原則是紅細胞總量、總血容量接近或回復正常，緩解病情，減少并發(fā)癥；以往傳統(tǒng)的方法主要是行靜脈放血及應用放、化療，使血容量降至正常。但其不良反應大，放血后有引起紅細胞及血小板反跳性升高的可能[2]，單放、化療易使紅細胞分解，引起溶解綜合征。我科2011年3月至2013年12月對36例PV患者使用血細胞分離機進行紅細胞單采術(shù)治療，現(xiàn)將結(jié)果及護理報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料 本組患者共36例，男26例，女10例，年齡28～80歲。其中頭暈頭痛21例，肝脾腫大5例，高血壓2例，腦梗死2例，右下肢靜脈血栓1例，痛風1例，皮膚瘙癢1例。
1.2 方法
1.2.1 治療方法 采用美國百特公司從CS-3000Plus連續(xù)流動式細胞分離機對每例患者進行紅細胞單采術(shù)1～3次，36例PV患者共進行紅細胞單采術(shù)54次。一次性分離管道為專用4R2210T，抗凝劑采用ACD-A，選擇程序“3-淋巴細胞收集程序”。每次單采全血處理量為1 500～4 000 ml，全血流速為30～55 ml/min，ACD-A抗凝劑平均用量約為350 ml，處理時間平均為100 min。單采后加用羥基脲、α-干擾素或小劑量高三尖杉等藥物治療。
1.2.2 評定方法 單采紅細胞前后均查血常規(guī)，取前后結(jié)果之差，比較用紅細胞單采術(shù)治療后紅細胞計數(shù)，Hb、HCT的下降值。
1.3 統(tǒng)計學處理 計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，紅細胞單采前后用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對檢驗數(shù)據(jù)配對t檢驗。
2 結(jié)果
PV患者紅細胞單位采前后血常規(guī)改變，表略。
3 護理
3.1 術(shù)前護理
3.1.1 心理護理 術(shù)前充分了解患者的心理狀態(tài)，并與之加強交流，講解疾病的相關(guān)知識及紅細胞去除術(shù)的治療原理，使患者了解該項治療的必要性和安全性，消除心理壓力，主動配合治療[3]。
3.1.2 環(huán)境準備 保持室溫24 ℃～26 ℃，濕度約55%，采集前用紫外線燈照射30 min，并更換床單位，禁止室內(nèi)人員走動，現(xiàn)場備常規(guī)搶救藥物和器材。
3.1.3 細胞分離機的準備 專人管理，定期維護，安裝不間斷電源，以應對突發(fā)停電影響采集。采集安裝管路前，分離機預熱10～20 min。 表1 PV患者紅細胞單采前后血常規(guī)比較
3.1.4 患者準備 采血管路通暢是紅細胞去除術(shù)順利進行的保證。采集前評估患者的靜脈，常選擇粗直彈性好的靜脈做穿刺。要求患者采集前多飲水，且勿進高脂飲食。
3.2 術(shù)中護理
3.2.1 一般護理 采集中應有一名經(jīng)驗豐富的護士全程陪護，協(xié)助患者取舒適的，做好保暖，并讓患者分散其注意力，緩解緊張情緒。并應嚴格無菌操作。
3.2.2 病情的觀察 予以心電監(jiān)護，密切觀察生命體征的變化，每30 min記錄一次血壓、脈搏、呼吸，并觀察全血流速、血漿流速，采集及回輸速度控制在40～50 ml/min，如有不適，可適當減緩速度。
3.2.3 不良反應的護理
3.2.3.1 低鈣反應 采血過程中應用的ACD-A抗凝劑，其主要成分為枸櫞酸鈉鹽，枸櫞酸根與血中鈣離子可形成難解離的可溶性絡合物，使血中鈣離子減少，出現(xiàn)低鈣癥狀；表現(xiàn)為口周發(fā)麻、惡心、腹部不適、面色蒼白、心率下降等。我科采用單采開始后30 min予生理鹽水20 ml加10%葡萄糖酸鈣10 ml緩慢靜脈推注，以預防枸櫞酸鹽中毒。出現(xiàn)低鈣癥狀明顯時，增加補鈣劑量。單采過程中口周發(fā)麻5例，四肢抽搐1例，予上述對癥處理后緩解。
3.2.3.2 血容量失衡 在單采過程中，如去除量和還輸量未能達到平衡，可引發(fā)低血容量或循環(huán)血量超負荷癥狀。血容量失衡是治療性血液成分單采技術(shù)可能致死的不良反應。因此，在單采過程中應對患者加強血壓監(jiān)護，紅細胞采集速度不宜過快，開始采集前予輸注生理鹽水或林格液以稀釋血液，但應控制輸液速度。所有患者單采中未出現(xiàn)血容量失衡現(xiàn)象。
3.2.3.4 迷走神經(jīng)反射 36例患者中有1例患者由于過度緊張在單采紅細胞開試后約20 min后出現(xiàn)迷走神經(jīng)反射。表現(xiàn)為惡心、嘔吐、面色蒼白、出冷汗，心率減慢為52次/min，血壓下降不明顯。予暫停單采，并予保暖，心理安慰，肌肉注射胃復安，約15 min后上述癥狀緩解。
3.3 術(shù)后護理 采集完畢后，盡可能回輸管路內(nèi)剩余的血細胞。因采血針頭粗大，采集后為防止穿刺處滲血，拔出針頭后要迅速用無菌紗布局部按壓20～30 min，直至無血液滲出；深靜脈穿刺要用肝素封管并做好護理。囑患者平臥30 min以上，進食糖水、牛奶等，以補充循環(huán)血量。抽血查血常規(guī)，并將檢驗結(jié)果及時反饋給患者，以增加患者治療疾病的信心。
4 討論
方法：回顧性分析我院2011年7月至2012年12月收治的37例急性壞疽性膽囊炎中發(fā)生了圍手術(shù)期并發(fā)癥的患者，統(tǒng)計其并發(fā)癥的發(fā)生率，就其臨床特點和診治經(jīng)驗進行總結(jié)。
結(jié)果：患者年齡與平均住院時間、術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生風險沒有明顯關(guān)系，而對住院費用的增加有明顯相關(guān)。
結(jié)論：通過加強圍手術(shù)期的管理，及時、早期發(fā)現(xiàn)術(shù)后存在的各種指標異常、肺部感染、切口愈合不良并給予對癥處理是患者早期痊愈的重要保障。
關(guān)鍵詞：壞疽性膽囊炎 圍手術(shù)期 并發(fā)癥
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.219
【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2013）08-0200-02
急性壞疽性膽囊炎是普通外科常見的急腹癥之一，臨床上起病急驟、病死率高，是隨急性膽囊炎疾病進展導致的病情最為嚴重的階段。其中，年齡、性別、糖尿病、肝硬化、白細胞計數(shù)、和膽囊增大是急性膽囊炎發(fā)生壞疽穿孔的獨立危險因素。[1]圍手術(shù)期各種并發(fā)癥的發(fā)生是導致患者病死率高、住院時間延長、費用增加的的重要因素。在我院2011年7月至2012年12月收治的119例急性膽囊炎患者中，發(fā)生膽囊壞疽患者37人，經(jīng)治療后篩選出16例發(fā)生了圍手術(shù)期并發(fā)癥的患者入組，統(tǒng)計其并發(fā)癥的發(fā)生率，就其臨床特點和診治經(jīng)驗進行總結(jié)，現(xiàn)報告如下：
1 資料與方法
1.1 一般資料。本組16例，男8例，女8例；年齡14-84歲，平均52.75歲。發(fā)病至入院時間5h-7d。臨床表現(xiàn)均有不同程度的右上腹疼痛伴腹膜刺激癥狀、發(fā)熱、寒戰(zhàn)及血象升高、B超提示膽囊增大。術(shù)后病理診斷均提示急性壞疽性膽囊炎。合并膽囊結(jié)石12例，無結(jié)石4例；膽總管繼發(fā)結(jié)石1例。
1.2 手術(shù)方法。本組均于入院后經(jīng)積極抗感染、解痙、補液支持治療后再全麻下行手術(shù)治療。手術(shù)方式為腹腔鏡膽囊切除術(shù)1例，腹腔鏡中轉(zhuǎn)開腹膽囊切除4例，開腹膽囊切除7例，開腹膽囊切除+膽道探查術(shù)3例，剖腹探查+膽囊壁活檢1例。手術(shù)時間1.0-4.6h，平均2.8h。其中1例行剖腹探查+膽囊壁活檢術(shù)患者因失血性休克住院急診手術(shù)，術(shù)中見腹腔出血500ml，膽囊窩部位血凝塊，膽囊正常形態(tài)完全消失，僅于膽囊窩內(nèi)凝血塊中取出膽固醇結(jié)石60余枚，術(shù)后并發(fā)肺部感染、肺不張、I型呼衰轉(zhuǎn)入ICU治療呼吸機輔助呼吸、纖支鏡吸痰后恢復良好、痊愈出院。另1例14歲男性患者因急性膽管炎入院，急診行開腹膽囊切除+膽道探查、T管引流術(shù)，術(shù)中見肝臟呈彌漫性結(jié)節(jié)性肝硬化、部分結(jié)節(jié)質(zhì)地灰白、質(zhì)硬，膽總管明顯擴張充血，打開膽管后取出暗紅色質(zhì)脆新生組織，術(shù)后病理報告考慮“膽管內(nèi)新生組織”為惡性腫瘤并出血壞死，術(shù)后診斷原發(fā)性肝癌并膽管癌栓形成、急性膽管炎、急性壞疽性膽囊炎。術(shù)后患者恢復尚可，拒絕進一步放化療，自請出院。
2 結(jié)果
2.1 各類并發(fā)癥發(fā)生率見表1：
2.2 比較發(fā)病年齡對患者并發(fā)癥發(fā)生、住院時間、及住院費用的影響。
術(shù)后經(jīng)積極抗感染、護肝及應用呼吸機進行高級生命支持等積極治療手段后，15例患者治愈出院。1例患者因感染中毒性休克并多器官功能衰竭，自請出院后第3日死亡。病死率6.25%。
3 討論
急性壞疽膽囊炎發(fā)病的主要因素有：①膽囊管梗阻或膽道壓力突然升高，高濃度膽鹽可直接損傷膽囊粘膜，引起急性炎癥改變；②合并細菌感染：一般通過膽道逆行性感染、多為腸道菌屬；血源性感染較為少見；③重癥胰腺炎，胰液反流等引起的化學性刺激；④在合并多器官功能障礙時的非結(jié)石性膽囊炎，膽囊粘膜受到低灌注、缺血缺氧性損害也是發(fā)生急性壞疽性膽囊炎的重要誘因之一。此類壞疽性膽囊炎多發(fā)生于高齡合并心血管疾病或代謝性疾病、嚴重創(chuàng)傷、感染等全身性嚴重疾病患者，膽囊穿孔、膽汁性腹膜炎發(fā)生率高，并發(fā)癥及死亡率均較高。對此類患者診治過程中我們體會到以下幾點：
3.1 早期明確診斷，正確選擇手術(shù)時機。急性壞疽性膽囊炎主要臨床表現(xiàn)為腹痛，多為右上腹或中上腹的持續(xù)性脹痛，發(fā)熱以及血象白細胞計數(shù)的明顯升高，B超等影像學可見膽囊腫大、壁厚、部分呈雙邊影，膽囊周圍炎性滲出等表現(xiàn)。但由于部分病人就診時間晚或臨床表現(xiàn)不典型，以不完全性腸梗阻、右下肺感染、彌漫性腹膜炎為主要癥狀就診的患者不在少數(shù)，這就要求臨床醫(yī)生在查看病人時提高警惕，避免漏診、誤診。在有些老年患者，由于膽囊位置較高而右上腹壓痛不明顯，腹壁松弛無腹膜刺激征，這時要注意肝區(qū)的叩擊痛是否明顯，通常肝區(qū)叩痛明顯的部位即為膽囊部位。合并不完全性腸梗阻病人，上腹部CT的檢查有助鑒別。部分病人膽囊壞疽穿孔后膽囊可以不大，膽汁性腹膜炎與胰腺炎引起的腹水有時難以鑒別，需要注意的是膽囊壞疽穿孔所致腹腔積液主要局限在右上腹，而胰腺形態(tài)改變不明顯，必要時可重復多次腹腔穿刺甚至置管引流以鑒別。值得一提的是，在CT或B超檢查中發(fā)現(xiàn)膽囊積氣的患者，需高度重視懷疑壞疽性膽囊炎的可能，這與引起膽囊壞疽的致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌有關(guān)[2]。
急性壞疽性膽囊炎一經(jīng)診斷原則上應早期急診手術(shù)治療。正確的手術(shù)時機的選擇對患者術(shù)后恢復有著重要的影響，有學者建議宜早期（
3.2 避免嚴重并發(fā)癥的發(fā)生。壞疽性膽囊炎急診手術(shù)術(shù)中最常見的并發(fā)癥有出血、膽管損傷、膽管殘留結(jié)石等。本組患者均行膽囊切除而術(shù)中均無膽管損傷或膽管殘余結(jié)石病例，個人體會是在術(shù)中要注意操作輕柔、避免粗暴的解剖和大塊組織的鉗夾離斷。對炎癥粘連嚴重的患者必要時行逆行膽囊切除術(shù)。普遍認為逆行切除膽囊會導致術(shù)中出血量增加，但對于壞疽性膽囊炎病人，大部分合并膽囊終末血供障礙，有的病人甚至在膽囊切除后都無法找到確切的膽囊動脈。術(shù)中認清膽囊壁解剖層次，剝離膽囊時注意避免進入肝床是減少術(shù)中出血的技巧之一。另外術(shù)中出血還可能因盲目鉗夾而導致膽管的損傷，因此精細的膽囊三角解剖十分重要。近三角區(qū)的分離避免長時間的電凝、手術(shù)中保持清醒的頭腦，時刻考慮到是否存在解剖變異都是避免膽管損傷的方法。對于術(shù)中膽總管擴張、捫及結(jié)石或膽囊管增粗并膽囊內(nèi)小結(jié)石的病人，術(shù)中膽管的探查也是十分必要的。如病情不允許膽囊切除時，因先搶救生命，同時行膽囊造口引流術(shù)，最大限度控制感染，待病情穩(wěn)定后再行膽囊切除術(shù)。[5]通過加強圍手術(shù)期的管理，及時、早期的發(fā)現(xiàn)術(shù)后存在的各種指標異常、肺部感染、切口愈合不良并給予對癥處理是患者早期痊愈的重要保障。
3.3 手術(shù)時間與患者治療效果的關(guān)系。通過對本組病例的統(tǒng)計研究我們發(fā)現(xiàn)，患者年齡與平均住院時間、術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生風險沒有明顯關(guān)系，而對住院費用的增加有明顯相關(guān)。
參考文獻
[1] 龍滌，方富義，閉永浩，等.急性壞疽性膽囊炎的危險因素分析[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26（15）；2737-2739
[2] 黃潔，秦帥，毛恩強，等.壞疽性膽囊炎_重癥急性胰腺炎的嚴重并發(fā)癥之一[J].中國實用外科雜志，2011，30（1）；76-79
[3] 楊野，劉宇，郭仁宣，等.老年急性膽囊炎外科治療時機和方式選擇（附438例分析）[J].中國實用外科雜志，2008，28（5）；376-377
【摘要】 應用BALB／c裸鼠為移植模型，將在體外擴增的陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）病人的CD34+CD59+細胞進行移植，研究其增殖能力和重建造血的情況，為實現(xiàn)PNH患者進行臨床自體骨髓移植（ABMT）或自體外周血干細胞移植（APBSCT）奠定基礎。本研究利用免疫磁珠雙陽性分選法，從PNH患者骨髓中分離出足夠數(shù)量的CD34+CD59+細胞進行體外擴增，并將體外擴增的細胞輸注給接受亞致死劑量照射的BALB／c裸鼠。結(jié)果顯示：移植6周后，用流式細胞術(shù)和DNA檢測方法均檢測到裸鼠骨髓、脾臟和外周血中人的CD45+細胞，而接受PNH病人CD34+CD59+細胞移植后的裸鼠，其血常規(guī)指標有一定恢復，但并未完全恢復。結(jié)論：PNH病人骨髓CD34+CD59+細胞體外擴增后仍能保持造血祖細胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。
【關(guān)鍵詞】 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥
Nude Mice Intraperitoneally Transfused with Ex Vivo Expanded Bone Marrow CD34+CD59+ Cells from Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria
Abstract
Ex vivo expanded human bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) were transplanted into BALB/c mice in order to investigate their proliferation ability and reconstruction of hemopoiesis，and to lay the groundwork for clinical ABMT/APBSCT in PNH patients. CD34+CD59+ cells were selected from the bone marrow mononuclear cells in PNH patients by using immunomagnetic positive double sorting. Sublethally irradiated BALB/c mice were transplanted with CD34+CD59+ cells enriched from bone narrow of PNH patients.The results showed that human CD45+ cells were detected in the bone marrow，spleen and peripheral blood of the nude mice by flow cytometry and DNA analysis at 6 weeks post-transplant. Blood routine indicators of nude mice were found to recover to some extent，but did not fully recover. It is concluded that ex vivo expanded bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria could keep their biological characteristics and ability to reconstruct hemopoiesis in irradiated BALB/c mice.
Key words paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；CD34+CD59+ cells；cell expansion；nude mice
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一種慢性溶血性疾病，其治療長期以來一直停留在對癥處理上，同種異體骨髓移植是目前唯一有效的根治方法，但由于HLA相合供體的缺乏、異體移植造成的免疫排斥和治療費用的昂貴限制其廣泛應用。因此，尋找有效的根治PNH的療法是我們臨床醫(yī)生迫切需要解決的問題。由于PNH病人體內(nèi)正?？寺∨c異?？寺〔⒋?，因此可以考慮對PNH病人進行自體骨髓移植（ABMT）或自體外周血干細胞移植（APBSCT）。PNH病人的造血祖細胞可以在體外收集，應用免疫磁珠雙陽性標記的方法將正常細胞與異?？寺》珠_，對正常細胞在一定條件下進行體外擴增，待化療和（或）免疫抑制劑盡量減少患者體內(nèi)異常造血干／ 祖細胞后，再回輸給病人重建造血以期根治PNH。我們以前的工作表明，應用免疫磁珠方法對細胞可進行兩次分選得到高富集度的CD34+CD59+細胞，并對CD34+CD59+細胞進行體外擴增，但擴增的細胞能否在體內(nèi)擔當重建造血的重任？本研究以BALB/c裸鼠為動物模型對此問題進行了探討。以裸鼠為動物模型對PNH患者造血細胞進行研究的問題，國內(nèi)尚未見有報道。本研究的結(jié)果將會加深對PNH發(fā)病機制的認識，并為PNH根治途徑的探討提供重要的實驗依據(jù)。
材料和方法
研究對象
8例PNH患者系我院門診和住院的病人，均按文獻〖1］標準確診，經(jīng)髂骨穿刺肝素抗凝獲取骨髓。
CD34+CD59+細胞的［2］免疫磁珠雙陽性法分離富集
常規(guī)分離骨髓單個核細胞(BMMNC)；CD34單克隆抗體標記及CD59單克隆抗體標記與免疫磁珠結(jié)合；用MiniMACS分選CD34+細胞；然后分離CD34+CD59+細胞及CD34+CD59-細胞；再用流式細胞儀測定CD34+CD59-細胞與CD34+CD59+細胞的比例。
細胞體外擴增培養(yǎng)
用本實驗室成熟的體外擴增培養(yǎng)體系進行擴增［3］，分別于第4、7、10、14天半量換液，補充含相同細胞因子及濃度的IMDM（表1），取出細胞進行有核細胞計數(shù)，臺盼藍染色，進行CD34+CD59+細胞比例測定及各系造血祖細胞檢測。CD34+CD59+細胞的擴增倍數(shù)由下述公式計算得出：
擴增倍數(shù)＝（擴增后的有核細胞數(shù)）× （CD34+CD59+％）÷擴增前的基數(shù)
裸鼠骨髓移植
BALB/c裸鼠（中國醫(yī)學科學院動物所提供），雌雄各半，6-8周齡，體重16-20 g，所有裸鼠在相對無菌及無特定病原體條件下飼養(yǎng)于中國協(xié)和醫(yī)科大學北京協(xié)和醫(yī)院動物房。移植前3小時接受X線照射預處理，照射面積35 cm×35 cm，照距100 cm，劑量率200 cGy/min，照射時間2.00-2.75分鐘，總劑量400-550 cGy［4，5］。
實驗分組
實驗組(8只)：經(jīng)腹腔輸注擴增后第7天含1×105的CD34+CD59+細胞；陰性對照組(4只)：輸注等量的無細胞培養(yǎng)液。Table 1. Source and final concentration of rHGFs（略）
人造血祖細胞植入裸鼠體內(nèi)的檢測
按參考文獻〖6］進行輸注PNH病人CD34+CD59+細胞后6-8周用硫噴妥鈉按50 mg/kg的濃度麻醉處死裸鼠。取外周血、兩側(cè)股骨的骨髓細胞及脾臟，用于人CD45+細胞的檢測及抽提基因組DNA，以檢測人特異的Alu序列，并進行人的造血祖細胞的分析。測定移植后血常規(guī)指標的變化，了解裸鼠造血重建情況。
統(tǒng)計學分析
運用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，對二者間的比較用t檢驗，三者間的比較用單因素方差分析或兩因素隨機區(qū)組的方差分析。
結(jié) 果
PNH患者骨髓中CD34+CD59+細胞的分選
8例PNH患者應用免疫磁株雙陽性分選法分選的CD34+CD59+細胞富集度為（85.73±5.42）％。根據(jù)以往的經(jīng)驗，造血祖細胞在擴增到第7天時擴增倍數(shù)最高。因此，本實驗中細胞體外擴增僅7-10天。CD34+CD59+細胞第7天時擴增19.78±3.11倍。
裸鼠生存情況的觀察
照射后存活的裸鼠在2-3周時均出現(xiàn)消瘦、皮膚散在出血點及干燥脫屑，3周后逐漸消失。PNH正常造血祖細胞（CD34+CD59+）體外擴增后輸注組裸鼠均存活6周以上。
人特異性CD45+細胞的檢測
實驗組存活的8只裸鼠中均檢測到人源性CD45+細胞，CD45+細胞數(shù)在外周血、骨髓及脾臟中分別為（3.10±1.24）%，（18.62±6.14）%，（15.65±2.45）%（圖1）；在 陰性對照組裸鼠未檢測到人CD45+細胞。
轉(zhuǎn)貼于
造血祖細胞在裸鼠體內(nèi)分化的檢測
進一步分析裸鼠骨髓中CD45+的人的細胞可以發(fā)現(xiàn)各系表達的標志。在實驗中我們檢測到B系的表達（CD19+）、T系的表達（CD3+）、髓系的表達（CD14+、CD33+）以及祖細胞的標志（CD34+、CD38+）。它們分別占CD45+細胞的（13.35±1.81）%、（3.50±1.23）%、（6.32±1.32）%、（11.28±1.03）%、（1.54±1.14）%和（4.71±1.12）%(圖2）。
特異性基因植入裸鼠的檢測
以正常人的陽性標本作為陽性對照，陰性對照未檢測到任何特異性條帶，實驗組小鼠的外周血、骨髓及脾臟組織中均可見到人的特異性Alu序列 (圖3)。
移植后裸鼠外周血血常規(guī)的檢測
陰性對照組在10-13天時的血象表現(xiàn)為三系細胞減低，尤以白細胞和血小板減少為顯著。實驗組在6-8周時的血常規(guī)檢查顯示，白細胞、血紅蛋白及血小板并沒有完全恢復，但較陰性對照組明顯改善（表2）。陰性對照組白細胞及血小板數(shù)同實驗組比較有顯著差異（P0.05）。Table 2. Comparison of blood routine from BACL/c mice post transplant（略）
討論
PNH是一種慢性難治的疾病，目前的治療主要是對癥治療，異基因骨髓移植是目前唯一有效的根治方法。Saso等［7］報道了最大宗的臨床試驗，有57例病人接受了清髓性異基因骨髓移植，其中48例以HLA相合同胞兄妹為供者的患者，2年生存率為56％；2例以孿生姐妹為供者的患者移植后8年及12年仍然存活；7例無關(guān)供者中只有1例移植后5年仍然存活。19例（33.3％）在移植后4個月內(nèi)死亡。治療失敗的主要原因為移植物抗宿主?。℅VHD）和感染。因此，骨髓組織的相容性對移植成功至關(guān)重要。由于PNH病人體內(nèi)呈異常造血與正常造血并存的狀態(tài)，如果能利用PNH病人自身的正常造血部分進行ABMT或APBSCT，那么既能避免異基因骨髓移植中的GVHD，又不存在相合供體缺乏的問題，而能安全有效地治療PNH［8］。但欲從骨髓及外周血中收集到足夠量的正常造血祖細胞（CD34+CD59+）以供ABMT或APBSCT之需是非常困難的，為此必須對PNH病人的CD34+CD59+細胞進行體外擴增。為了給臨床應用提供實驗依據(jù)，必須將體外擴增后的PNH病人CD34+CD59+細胞移植給體重較小的動物，以了解擴增后的CD34+CD59+細胞在體內(nèi)的生物學特性。
本研究采用磁珠雙陽性分離方法，即有兩種抗原標志的同一細胞被分離純化出來。在無血清體外培養(yǎng)體系中經(jīng)SCF、IL-3、IL-6、FLT-3、TPO、EPO組合作用后，PNH病人的有核細胞數(shù)、CD34+CD59+細胞及CFC均有不同程度的擴增。PNH患者CD34+CD59+細胞擴增第7天時有核細胞數(shù)可擴增137.22±8.54倍，CD34+CD59+細胞絕對值可擴增19.78±3.11倍，CFC擴增34.22±6.81倍。我們通過選擇適宜的細胞因子組合及適宜的擴增時機，在體外培養(yǎng)的條件下，能夠?qū)NH病人骨髓來源的正常造血祖細胞(CD34+CD59+)在數(shù)量上進行有效的擴增，那么擴增后CD34+CD59+細胞是否仍具有向多系分化重建造血的能力?肖娟等［9］對PNH病人骨髓CD34+CD59+的CD34+抗原表達情況及CFC進行研究發(fā)現(xiàn):PNH病人的CD34+CD59+細胞的不同擴增時段（4、7、10、14天）的CD34+CD59+細胞與其相應的CFC相比較，呈正相關(guān)，說明擴增后的CD34+CD59+細胞仍具有形成CFU的能力，具備一定的重建造血性能。為進一步將體外擴增的CD34+CD59+細胞應用于臨床，我們以BACL/c裸鼠為移植模型，并以該模型為基礎，進一步分析了PNH病人造血祖細胞的生物特性。
雖然骨髓被認為是造血的主要部位，但PNH病人體外擴增的CD34+CD59+細胞移植給裸鼠后，其外周血、脾臟中均可檢測到人的CD45+細胞，但其比例低于骨髓。應用流式細胞儀進行三色法分析CD45+細胞亞群中各系細胞的表達發(fā)現(xiàn)：裸鼠骨髓內(nèi)的CD19、CD3、CD34、CD33、CD14的表達均為陽性，其中CD3的比例最低，為（2.54±1.14）%，這可能與裸鼠本身具有的T細胞免疫缺陷有關(guān)。
PNH病人正常造血祖細胞體外擴增后輸注給BACL/c裸鼠，處死裸鼠后對其外周血象的檢查發(fā)現(xiàn)，三系血細胞均未恢復正常，血紅蛋白降低最明顯，這可能與PNH病人本身存在的造血衰竭有關(guān)，而且體外實驗也發(fā)現(xiàn)，PNH病人CD34+CD59+細胞的擴增倍數(shù)低于正常人。但同陰性對照相比仍有顯著差異，說明PNH病人CD34+CD59+細胞經(jīng)體外擴增后仍能保持造血祖細胞的特性并且能支持造血。對PNH病人骨髓來源的CD34+CD59+細胞進行體外擴增仍具有廣闊的前景：①體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的粒系及巨核系細胞可用于克服移植早期的粒細胞減少及血小板減少癥。②所有PNH病人骨髓中造血祖細胞的數(shù)量仍少，不能達到基因治療所需的靶細胞數(shù)量，但通過對PNH病人造血祖細胞體外擴增，則可能滿足基因治療的需要。
參考文獻
1張之南主編.血液病診斷及治療標準.第二版，北京:科學出版社，1998: 88-90
2肖娟，武永吉，張之南等.磁珠雙陽性分選法在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者骨髓CD34+CD59+細胞體外擴增的應用. 中國實驗血液學雜志，2003；11： 179-183
3肖娟，武永吉，張之南等.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者骨髓CD34+CD59+細胞的體外擴增.中華血液學雜志，2002；23: 568-570
4Wermann K，F(xiàn)ruehauf S，Haas R，et al. Human-mouse xenografts in stem cell research. J Hematother，1996；5: 379-390
5趙小英，吳東，徐榮臻. 裸鼠腹腔輸注體外擴增人臍血干／祖細胞的研究. 中華血液學雜志，2002；23: 656-657
6Zhang XB，Li K，F(xiàn)ok TF，et al.Cobblestone area-forming cells，long-term culture-initiating cells and NOD/SCID repopulating cells in human neonatal blood: a comparison with umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant，2002；30: 557-564
7Saso R，Marsh J，Cevreska L，et al. Bone transplants for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Br J Haematol，1999；104: 392-396
關(guān)鍵詞：丹參通絡解毒湯；急性心肌梗死；單核細胞趨化蛋白-1；可溶性細胞間黏附因子-1；Toll樣受體4；炎癥反應；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.014
中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0057-05
Abstract： Objective To explore the effects of Danshen Tongluo Detoxication Decoction on the inflammatory response of rats with bone marrow stem cell （BMSC） transplantation in acute myocardial infarction （AMI）； To discuss its mechanism of action. Methods The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. After the modeling， SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group and BMSCs group （BMSCs transplantation group）， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group， 10 rats in each group. BMSCs cell suspension was injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area； Chinese medicine or normal saline were administered for gavage. 4 weeks later， the contents of MCP-1 and sICAM-1 in each group were detected by ELISA. TLR-4 expression was measured by Western blot method， and HE staining was used to observe the myocardial tissue pathological changes. Results Compared with the model group， the contents of MCP-1 and sICAM-1 and the protein expression of TLR-4 in BMSCs group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group decreased， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group was better than BMSCs group （P
Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats
急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致殘率逐年增高，成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。近年來骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、體外擴增能力強、可來源于自身、應用于臨床的可行性高等優(yōu)勢[1]，成為治療AMI新途徑研究的熱點。研究顯示，BMSCs的應用可促進心肌組織細胞再生，刺激梗死區(qū)毛細血管新生，調(diào)節(jié)梗死區(qū)域心肌組織細胞的凋亡，改善心臟功能[2]。同時，有實驗研究表明，中藥干預BMSCs可調(diào)控BMSCs的歸巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，為BMSCs移植提供良好微環(huán)境[3]。丹參通絡解毒湯由丹參、水蛭、玄參、黃連等配伍組成，全方具有益氣活血、通絡解毒功效，臨床治療冠心病療效顯著[4]。為研究該方對AMI后大鼠的抗炎作用，本實驗通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法構(gòu)建AMI大鼠模型，觀察丹參通絡解毒湯對大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、可溶性細胞間黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌組織Toll樣受體4（TLR-4）蛋白表達的影響，探討其作用機制。
1 實驗材料
1.1 動物
10～12周齡清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±30）g，用于移植；4～6周幼齡大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（100±10）g，湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通飼料飼養(yǎng)，自由飲食，12 h/ 12 h明暗環(huán)境交替。
1.2 藥物
丹參通絡解毒湯（丹參15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，當歸15 g，紅花10 g，玄參15 g，黃芩10 g，梔子15 g，黃連6 g，黃芪30 g等），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，由該院制劑室煎煮，濃縮至含原藥材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 主要試劑與儀器
MCP-1、sICAM-1 ELISA試劑盒、TLR-4單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP標記二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；Galaxy型CO2培養(yǎng)箱，英國New Brunswick公司；倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯；多導生理信號采集系統(tǒng)，成都儀器廠；DW-2000型動物人工呼吸機，上海嘉鵬科技有限公司；mini protean 3 cell型電泳儀，BIO-RAD公司。
2 實驗方法
2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞制備和培養(yǎng)
從4～6周清潔級雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集細胞，采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法進行分離、培養(yǎng)。經(jīng)多次換液和消化，將傳至P3的BMSCs采用流式細胞儀檢查細胞表面抗原，以CD34陽性率低于5%及CD90、CD44陽性率高于95%鑒定所得細胞為高純度的BMSCs。
2.2 造模
參照文獻[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，氣管插管連接小動物呼吸機，開胸暴露心臟，于肺動脈圓錐與左心耳右緣之間交點和心尖的假想連線中下1/3處穿線結(jié)扎。以心電圖出現(xiàn)QRS波群增高增寬伴ST段抬高、心肌組織顏色發(fā)紺為結(jié)扎成功；以結(jié)扎部位以下心肌組織搏動減弱、顏色變蒼白，及心電圖顯示肢體Ⅱ?qū)?lián)R波振幅升高、QRS波改變、J點偏移超過0.1 mV或出現(xiàn)病理性Q波，證實大鼠AMI造模成功[6]。
2.3 分組及給藥
當P3或P4代大鼠BMSCs達70%～80%融合時進行移植。SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、BMSCs組、丹參通絡解毒湯組（中藥組）、丹參通絡解毒湯+BMSCs組（中藥+BMSCs組），每組10只。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余各組進行AMI造模。BMSCs組和中藥+BMSCs組冠狀動脈結(jié)扎30 min后，于心肌梗死區(qū)邊緣心肌組織3個位點直接注入共100 μL BMSCs細胞懸液（含細胞數(shù)3×106），假手術(shù)組和模型組則注入100 μL PBS。術(shù)后各組分籠飼養(yǎng)，給予常規(guī)飼料和飲水，48 h后，每日9：00中藥組和中藥+BMSCs組給予1 mL/100 g丹參通絡解毒湯藥液灌胃，其余各組用給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。
2.4 心肌組織病理改變的觀察
術(shù)后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血后，脫頸處死大鼠，迅速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，取左心室缺血處心肌組織置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚4 μm），HE染色觀察心肌組織的病理改變。
2.5 血清單核細胞趨化蛋白-1、可溶性細胞間黏附因子-1水平測定
術(shù)后4周，采集大鼠腹主動脈血5 mL，3500 r/min離心10 min，取血清，ELISA檢測MCP-1、sICAM-1水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。
2.6 心肌組織Toll樣受體4蛋白表達測定
提取心肌組織梗死邊緣區(qū)心肌組織總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，電泳后電轉(zhuǎn)于NC膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜。孵育TLR-4抗體（1∶500）過夜。TBST洗滌3次，加入1∶15 000稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育2 h，TBST洗滌3次，通過熒光掃描儀采集信號，應用Quantity One軟件分析計算灰度值。
3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以―x±s表示，進行方差齊性檢驗，方差齊采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗或Welch檢驗。P
4 結(jié)果
4.1 丹參通絡解毒湯對模型大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響
假手術(shù)組心肌組織未見明顯的病理形態(tài)改變，橫紋較清晰；模型組大鼠心肌組織病理形態(tài)改變較明顯，心肌組織間質(zhì)炎性細胞浸潤、細胞腫脹明顯，部分心肌組織細胞變性、壞死，肌束排列不整齊；干細胞移植組細胞腫脹及肌束紊亂程度較模型組減輕；中藥組有炎性細胞浸潤，細胞腫脹輕度，肌束紊亂程度有所改善；中藥+BMSCs組肌束排列較整齊，細胞腫脹輕度，炎性細胞浸潤改善，細胞溶解情況減少。結(jié)果見圖1。
4.2 丹參通絡解毒湯對模型大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1、可溶性細胞間黏附因子-1含量的影響
與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明顯升高（P
4.3 丹參通絡解毒湯對模型大鼠心肌組織Toll樣受體4蛋白表達的影響
假手術(shù)組心肌組織有少量TLR-4表達，模型組TLR-4表達明顯增多（P
5 討論
AMI后，由于組織缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎癥調(diào)節(jié)系統(tǒng)，誘導心肌組織細胞壞死、凋亡等梗死后效應，機體為了清除壞死細胞，又進一步激活炎癥反應，從而導致心肌組織損傷[7]，故通過調(diào)節(jié)AMI后免疫炎癥反應來減輕心肌組織缺血性損傷十分關(guān)鍵。AMI是一個急性炎癥過程，大量實驗研究表明，ICAM-1可以介導白細胞和內(nèi)皮細胞的滾動和穩(wěn)定黏附，并在MCP-1等炎性因子的協(xié)助下啟動局部的炎癥反應，AMI后MCP-1、sICAM-1呈高表達狀態(tài)[8-9]。sICAM-1為ICAM-1在組織損傷后經(jīng)蛋白酶裂解脫落存在于血清中的可溶性形式。TLR-4作為炎性反應的跨膜受體，可通過MyD88依賴性及非依賴性細胞信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)NF-κB早期及晚期的活化，致使ICAM-1的表達量上調(diào)[10]，并促使MCP-1等趨化因子的合成及釋放，開啟炎癥反應。因此，TLR-4與sICAM-1、MCP-1關(guān)系密切，都參與AMI過程。本實驗結(jié)果顯示，AMI后大鼠心肌組織TLR-4表達增加，而血清sICAM-1、MCP-1水平也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，提示AMI可能通過TLR-4激活核因子-κB，從而誘導sICAM-1、MCP-1的表達和釋放，參與AMI的病理過程。
BMSCs是一種存在于骨髓組織中具有自我增殖及能分化為心肌組織細胞、血管內(nèi)皮細胞潛能的多能干細胞。無論是在動物模型研究還是臨床前試驗中，通過BMSCs移植治療缺血性疾病都取得了顯著的成果[11-12]。有研究顯示，BMSCs不僅具有獨特的免疫學特性，還能在移植后在宿主體內(nèi)存活并對AMI后病理性免疫反應起到一定的調(diào)節(jié)作用。中藥干預BMSCs移植可促進BMSCs的歸巢、定植及分化，為BMSCs移植提供良好微環(huán)境，從而提高移植后的成活率，增強對缺血心肌組織的保護作用[13]。前期實驗研究表明，疏肝活血中藥可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形態(tài)和心功能[14]，益氣活血方對骨髓干細胞具有動員作用[15]。
冠心病屬中醫(yī)學“心痛”“胸痹”“真心痛”等范疇，其發(fā)病主要是由于六犯心、七情內(nèi)傷、飲食不節(jié)、年老體弱等致心臟的陰、陽、氣、血虧損，痰濁、瘀血、氣滯、寒凝等阻于心絡。然而，外邪和內(nèi)邪在機體中積聚日久，逐漸蘊積成毒，毒損心絡，導致心絡不通，即使心肌組織再灌注治療血液再通，但缺血心肌組織原有代謝毒物未能排出，再灌注產(chǎn)生的氧自由基和炎癥因子等新的“濁毒”對心體的損害又進一步加重。丹參通絡解毒湯是多年臨床經(jīng)驗方，由丹參、玄參、黃芩、水蛭、川芎等組成，方中丹參主要有效成分丹參酮和丹酚酸具有擴張冠狀動脈、防止心肌組織缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)、降低心肌組織耗氧量、抑制炎癥反應等作用[16]；川芎有效成分川芎嗪可改善冠狀動脈的血液循環(huán)，減輕心肌組織缺血后心肌組織細胞損傷，減少梗死面積[17]；玄參提取物降低炎癥細胞因子過量表達，對心肌組織具有明顯保護作用[18]；黃芩有效成分黃芩素、黃芩苷具有抗氧化、清除自由基的作用，從而修復損傷心肌組織[19]。全方具有益氣活血、通絡解毒的功效。本實驗結(jié)果顯示，該方能有效降低AMI大鼠血清sICAM-1、MCP-1含量，減少心肌組織TLR-4的表達，明顯改善心肌組織病理形態(tài)，提示丹參解毒通絡湯可能通過抑制TLR-4激活，減少sICAM-1、MCP-1的表達和釋放，從而抑制AMI后的炎癥反應，修復心肌組織損傷。并且，丹參通絡解毒湯聯(lián)合干細胞移植對大鼠AMI后干預作用較單純丹參通絡解毒湯和單純干細胞移植干預作用更為顯著，提示丹參通絡解毒湯與BMSCs移植的聯(lián)合作用，可以通過抑制TLR-4激活，增強對梗死心肌局部炎癥的抑制作用，進而加強對梗死心肌的修復作用，減輕心室重構(gòu)。
綜上所述，丹參通絡解毒湯聯(lián)合干細胞移植可以抑制大鼠AMI后炎癥反應，改善急性心肌組織缺血大鼠的心肌損傷，其機制可能是通過調(diào)節(jié)TLR-4介導的炎癥反應實現(xiàn)的。
參考文獻：
[1] DHARMASAROJA P. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemic stroke[J]. J Clin Neurosci，2009， 16（1）：12-20.
[2] 余紅，朱錦云，王建安，等.干細胞治療缺血性心肌病研究進展[J].中國介入心臟病學雜志，2015，23（5）：286-290.
[3] 劉慧萍，谷旭宇，張國民，等.中醫(yī)藥在干細胞移植中的作用[J].中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（3）：606-608.
[4] 李雅婧，李鑫輝，黃淼鑫，等.李鑫輝教授治療冠心病經(jīng)驗[J].中國中醫(yī)急癥，2015，24（11）：1954-1955.
[5] 楊濤濤，肖潁，奚賽飛，等.大鼠心肌梗死模型構(gòu)建和評價方法的改良[J].中國比較醫(yī)學雜志，2014，24（2）：46-51.
[6] 楊洋.加味丹參飲含藥血清對hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs移植IRI大鼠心肌血管新生的研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2013.
[7] FRANGOGIANNIS N G. Regulation of the inflammatory response in cardiac repair[J]. Circ Res，2012，110（1）：159-173.
[8] KOBUSIAK-PROKOPOWICZ M， ORZESZKO J， MAZUR G， et al. Kinetics of chemokines in acute myocardial infarction[J]. Kardiol Pol， 2005，62（4）：301-314.
[9] JEGIER B， JASZEWSKI R， KURNATOWSKI P， et al. Mycotic DNA in non-atherosclerotic aortic wall of coronary patients is associated with sICAM-1 expression[J]. Circ J，2010，74（4）：749- 753.
[10] ZEUK E S， ULMER A J， KUSUMOTO S， et al. TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J]. Cardiovasc Res，2002，56（1）：126-134.
[11] WILLIAMS A R， HATZISTERGOS K E， ADDICOTT B， et al. Enhanced effect of combining human cardiac stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells to reduce infarct size and to restore cardiac function after myocardial infarction[J]. Circulation， 2013，127：213-223.
[12] SPAETH E L， KIDD S， MARINI F C. Tracking inflammation-induced mobilization of mesenchymal stem cells[J]. Methods Mol Biol， 2012，904：?173-190.
[13] 李慧影，馬亞珂，楊岳，等.中藥干預骨髓干細胞治療缺血性心臟病研究進展[J].湖北中醫(yī)藥大學學報，2015，17（6）：107-109.
[14] 李鑫輝，黃政德，謝雪姣，等.疏肝活血中藥對骨髓間充質(zhì)干細胞移植心肌缺血再灌注損傷大鼠心功能和心肌病理形態(tài)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（8）：54-56.
[15] 李鑫輝，黃政德，蘇麗清，等.益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠血管新生的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（8）：1848-1850.
[16] 楊志霞，林謙，馬利，等.丹參對心血管疾病藥理作用的文獻研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7（2）：93-97.
[17] 金玉青，洪遠林，李建蕊，等.川芎的化學成分及藥理作用研究進展[J].中藥與臨床，2013，4（3）：44-48.
借款合同擔保書
編號：_________
保證人：_________
法定代表人：_________
地址：_________
開戶銀行：_________
帳戶：_________
_________銀行：
鑒于你行向_________(下稱“借款人”)提供(幣種)_________貸款(金額)_________(大寫：_________)(下稱“貸款”)。該借款合同(下稱“合同”)編號為_________。該貸款期限為_________，利率為_________，用于_________。本保證人已了解并同意“合同”所有條款，應“借款人”要求，現(xiàn)本保證人同意為上述“貸款”全額擔保，特此開立以你行為受益人的無條件的、不可撤銷的擔保書，向你行保證如下：
一、本保證人保證“借款人”全面履行“合同”。如“借款人”未能按“合同”規(guī)定償付各期到期(包括被宣布到期)應付款項，包括本金、利息、費用、罰息、違約金和賠償金(以下稱“到期應付款項”)，不論由何原因造成，對此全部和任何“到期應付款項”，本保證人保證按下述第二條規(guī)定承擔連帶償付責任和/或連帶賠償責任。
二、如果“借款人”未能按“合同”規(guī)定如數(shù)償付上述“一期應付款項”，你行即有權(quán)直接向本保證人索償，而無須先行向借款人追償(/處分抵押品)，本保證人保證在收到你行第一次書面索付通知后十五天內(nèi)，即無條件按通知要求將上述“借款人”的全部“到期應付款項”以“合同”規(guī)定的幣種主動支付給你行，應支付額計算至本保證人實際支付日。上述索付通知書，即作為付款憑證，對本保證人具有法律約束力。
三、如果本保證人未能按前條規(guī)定期限履行上述擔保責任，由此造成的延付利息和你行的其它經(jīng)濟損失由本保證人承擔;同時，你行有權(quán)從本保證人存款帳戶中扣收上述全部“到期應付款項”和延付利息。本保證人保證不提出異議和抗辯。
四、本保證人同意，今后若需追加“貸款”金額，對不超過“合同”金額_________%的追加貸款部分，按本擔保書規(guī)定承擔擔保義務。
五、在“合同”項下全部應付款項清償完畢之前，本保證人不能行使由于履行本保證項下義務而獲得的任何代位權(quán)和索償權(quán)。如果“借款人”向本保證人提供抵押品，非經(jīng)你行書面同意，本保證人也不應行使抵押項下的權(quán)利;如果經(jīng)你行同意處理抵押品，其所得全部項保證首先用于向你行償付上述“到期應付款項”。
六、本保證人在此同意，如果發(fā)生下列任何一種或數(shù)種情況時，本擔保書第一、二、三、四條規(guī)定的連帶償付責任(/連帶賠償責任)絲毫不受影響，本擔保書繼續(xù)有效。
1.本擔保項下所有當事人變更各自的名稱、地址、合資合作合同、企業(yè)章程、法定代表人、經(jīng)營范圍、企業(yè)性質(zhì)，或借款人合并、分立、停業(yè)、撤銷、解散、破產(chǎn)等;
2.你行延緩行使“合同”規(guī)定的權(quán)利和/或本擔保項下的權(quán)利，或?qū)Α百J款”項下的還款給予任何寬限，或與“借款人”之間達成其它任何形式的和解或變通執(zhí)行方式，無論是否通知本保證人;
3.“借款人”執(zhí)行其上述主管部門下達的任何行政指令和規(guī)定，或“借款人”與任何單位簽署任何合同、協(xié)議、契約及其它文件;本保證人上級主管部門下達的任何行政指令和規(guī)定。
七、如果全部或部分“到期應付款項”由“借款人”清償以后，發(fā)生“借款人”破產(chǎn)被清盤，而根據(jù)法律規(guī)定該全部或部分清償無效，屆時，本擔保書對該全部或部分“到期應付款項”繼續(xù)承擔本擔保書規(guī)定的擔保義務。
八、本保證人在此同意及確認，如你行與“借款人”修改、補充、刪除“合同”條款，絲毫不影響上述第一、二、三、四條規(guī)定的擔保責任和義務，但是變更“貸款”用途條款者除外。除“貸款”用途條款變更以外，“合同”中其他條款的變更無需征得本保證人同意。“合同”中與擔保金額和期限有關(guān)的條款變更以后，本擔保書的擔保期限即自動順延，上述擔保義務不變，除非本保證人主動償付全部“到期應付款項”;擔保金額則按本擔保書規(guī)定的范圍及上述期限變更后的貸款利率執(zhí)行，除非本保證人另有書面承諾。
九、本保證人將按你行要求定期提供有關(guān)的財務報表，并將上述第六條第1款中本保證人的變更情況及時通知你行。
十、你行可自主轉(zhuǎn)讓本擔保項下的全部或部分權(quán)利，本擔保書的受益人包括你行、你行的繼承人和受讓人。
十一、本保證人的繼承人、人或受讓人將受本擔保書所有條款的約束，承擔本擔保項下的全部擔保責任。但非經(jīng)你行書面同意，本保證人不會轉(zhuǎn)讓任何擔保義務。
十二、本擔保書是連續(xù)性的擔保，自開立之日起生效，直至“合同”項下全部“到期應付款項”償清后自動失效。
十三、在執(zhí)行本擔保書過程中如有爭議，應通過友好協(xié)商解決。經(jīng)協(xié)商不能解決的，應向本擔保項下受益人所在地主管法院提起訴訟。
十四、本擔保書正本一式_________份，你行執(zhí)_________分，本保證人和“借款人”各執(zhí)一份。
保證人(公章)：_________
簽發(fā)人(簽字)：_________
職務：_________
根據(jù)_________________（以下簡稱借款人）的貸款申請和你行與借款人于_______年_______月_______日簽訂的貸款合同（協(xié)議或契約），你行貸給借款人人民幣金額（大寫）_______________貸款利率_______，貸款期限自___________至___________
在此，我_______（以下簡稱擔保人）愿為上述合同中的借款人提供擔保，并愿為之承擔在合同中所有連帶經(jīng)濟責任，特鄭重聲明如下：
第一條 奉擔保人是經(jīng)上級主管部門批準成立、工商行政管理部門發(fā)給營業(yè)執(zhí)照的法人。本擔保人以足夠償還本擔保金額的財產(chǎn)作保證，保證履行本擔保書所規(guī)定的義務。本擔保人并在此聲明，本擔保書的開立已依法辦妥一切必要手續(xù)，是合法的、有效的。
第二條 本擔保書擔保最高金額為貸款的本金人民幣_______萬元及該貸款的全部應付利息及費用。
第三條 本擔保書為五條件不可撤銷的擔保文件，擔保人的任何其他經(jīng)濟行為不改變本擔保書的真實性和有效性。
第四條 擔保人收到你行出具的借款人無力支付到期應付款項的證明及要求擔保人履行擔保責任的付款通知后，保證按付款通知規(guī)定的付款日，主動五條件向你行付清全部應付擔?？铐?。你行出具的借款人無力支付到期應付款項的證明和要求擔保人履行擔保責任的付款通知是終結(jié)性的，對借款人和擔保人均有約束力。
第五條 本擔保書不受借款人上級單位任何指令的制約，不受借款人與任何單位簽訂的任何協(xié)議、文件的制約，也不受借款人破產(chǎn)、無力清償借款、喪失企業(yè)資格、更改組織章程及關(guān)、停、并、轉(zhuǎn)等各種變化的制約，本擔保書始終有效。
只要擔保的貸款本金不增加，你行對本擔保貸款的合同任何修改或變通執(zhí)行，均不改變擔保人對貸款本息、費用償付的擔保責任。
第六條 擔保人若未按你行通知期限償款，擔保人在此授權(quán)你行直接借記擔保人賬戶，賬號附后。
第七條 擔保人如遇撤銷、改組、破產(chǎn)或其他原因，失去擔保資格和能力時，須提前3個月主動通知你行并推薦繼承擔保人，經(jīng)你行確認繼承擔保人后，擔保人協(xié)助辦理擔保責任轉(zhuǎn)移手續(xù)。在轉(zhuǎn)移擔保責任未辦妥前，擔保人仍承擔擔保責任。
第八條 本擔保書自簽發(fā)之日起生效，至借款人或擔保人償清全部借款本息時自動失效。
第九條 本擔保書解釋于______________銀行。
擔保人（蓋章）：________________
法定代表（蓋章）：______________
擔保人地址：____________________
第一章 總則
第一條 為規(guī)范公司的人事入職管理，特制訂本規(guī)定。
第二章 試用及報到
第二條 新進人員入職資格：
1、 符合公司用人條件，并已通過面試、復試、終試者;
2、 經(jīng)核查無虛假資料及經(jīng)歷;
3、 在原單位離職交接清楚;
4、 無傳染性疾病;
5、 無犯罪記錄。
第三條 員工錄用前應辦理報到手續(xù)，并按規(guī)定時間上班，由考勤員制卡，核定發(fā)薪日期。逾期未辦理者，由備取人員依次侯補。
第四條 報到應備資料及事項：
1、 一寸彩色照片四張;
2、 社會保險卡復印件一份(已辦保險者提供);
3、 身份證復印件一份及原件;
4、最高學歷證原件、復印件各一份(含畢業(yè)證、學位證、英語等級證)，原件交人才交流中心驗證后退回;
5、專業(yè)技術(shù)資格證明復印件一份及原件(專業(yè)人員提供)，原件與復印件核對后退回;
6、 體檢證明。
第五條 公司有意向錄用之人員，如為倉管、司機、送貨、出納之職務，人力部/分公司行政人事部則須先派人進行家訪，了解其家庭情況，并做背景調(diào)查，將調(diào)查結(jié)果記錄并存于員工個人檔案。
第六條 由于工作需要，新聘員工可經(jīng)人力部經(jīng)理批準后先上崗，但須于5個工作日內(nèi)辦妥入職及擔保手續(xù)，逾期未辦完手續(xù)或入職資格不符合公司規(guī)定者，以自動離職處理。
第七條 新聘人員試用期為3個月，期滿考核合格可轉(zhuǎn)為正式員工。
第八條 員工在試用期內(nèi)品行和能力欠佳不適合工作者，可隨時停止使用。
第九條 員工一經(jīng)錄用，即簽訂公司所在地勞動部門正規(guī)《勞動合同書》，交勞動部門鑒證，并辦理社會保險。
第三章 擔保
第十條 本公司員工均應覓擔保人，辦理擔保手續(xù)，擔保人之責任均按《擔保書》中的規(guī)約執(zhí)行。
第十一條 本公司員工擔保人應具有下列資格：
1、 擔保人具有愛施德公司所在地常住戶口;
2、 有正當職業(yè)及穩(wěn)定經(jīng)濟來源;
3、 有長期穩(wěn)定的住所;
4、 不能為本公司在職員工;
5、 擔保人無犯罪前科。
第十二條 擔保等級：
1、 一級擔保：適用于倉管、司機、送貨、出納;
2、 二級擔保：適用于其他人員。
第十三條 擔保手續(xù)：
1、 一級擔保：
A) 擔保人提供戶口本、身份證、房產(chǎn)證原件及復印件各一份(人力資源部/分公司行政人事部進行核對后將原件退回);
B) 擔保人提供工作單位地址、單位電話、家庭住址、家庭電話;
C) 擔保人須親自到公司辦理擔保手續(xù)，并簽訂《擔保書》。
2、 二級擔保：
A) 擔保人提供身份證原件及復印件各一份(人力資源部/分公司行政人事部進行核對后將原件退回);
B) 擔保人提供工作單位地址、單位電話、家庭住址、家庭電話;
C) 擔保人須親自到公司辦理擔保手續(xù)，并簽訂《擔保書》。
第十四條 擔保人之工作單位或住址如有變更時，應由擔保人或被保人以書面形式通知人力資源部辦理變更。
第十五條 擔保人如因故欲退?；蛞蚱渌鹿蕟适ＹY格時，應及時以書面形式通知公司人力部，由被保人另覓新?lián)Ｈ宿k妥換保手續(xù)，發(fā)還原繳擔保書后方可解除原擔保責任。
第十六條 本公司對員工之擔保人如發(fā)現(xiàn)不妥時可隨時通知被保人限期換保，在換保期間如有必要可暫停其職務，待換保手續(xù)辦妥后才準許復職。
第十七條 本公司員工正常離職，經(jīng)辦妥移交手續(xù)后3個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何弊端時發(fā)還擔保書，解除擔保責任。
第十八條 擔保核查，核查人為公司人力部檔案管理人員、分公司行政人事部指定負責人員。
1、 一級擔保核查：
A) 核查擔保人家庭住址和聯(lián)系方式，確認是否與房產(chǎn)證地址相符;
B) 核查擔保人工作單位、單位地址及單位電話;
C) 每半年核查一次，并作好記錄。
2、 二級擔保核查：
A) 核查擔保人家庭電話、工作單位及單位電話;
B) 每一年核查一次，并作好記錄。
第四章 背景調(diào)查
第二十條 調(diào)查等級：
1、 一級調(diào)查：適用于倉管、司機、送貨、財務及經(jīng)理級以上人員;
2、 二級調(diào)查：適用于業(yè)務人員、門店管理人員及保安、更夫;
3、 三級調(diào)查：適用于其他人員。
第二十一條 背景調(diào)查，調(diào)查人為公司人力部入、離職管理人員，分公司行政人事部指定負責人員，進行電話查訪(根據(jù)《員工登記表》信息)。
1、 一級調(diào)查：
A) 查訪內(nèi)容：最近兩家單位工作內(nèi)容及表現(xiàn)、同事關(guān)系、離職原因和離職手續(xù)辦理情況;家庭住址、電話等信息的真實性。
B) 查訪對象：原單位人力資源部、直接上司、相關(guān)人員。
2、 二級調(diào)查：
A) 查訪內(nèi)容：最近一、二家單位工作內(nèi)容及表現(xiàn)、同事關(guān)系、離職原因和離職手續(xù)辦理情況;家庭住址、電話等信息的真實性。
B) 查訪對象：原單位人力資源部、直接上司。
3、 三級調(diào)查：進行電話抽查單位及家庭信息。
第五章 臨時員工入職管理
第二十二條 各部門、分公司有臨時性工作，需雇用臨時人員從事，應填《人力需求申請》，注明工作內(nèi)容，期間呈部門經(jīng)理及分公司負責人批核，人力部核準后招募。
第二十三條 雇用限制：
1、 年未滿16歲者，不得雇用;
2、 經(jīng)管財、物、倉儲等主要工作不得雇用;
3、 雇用期不超過3個月(鐘點工不在此限)。
第二十四條 辦理入職報到手續(xù)，可視崗位情況確定入職所需資料及辦理三級擔保，簽訂《擔保書》。
第六章 分公司入職資料上報
第二十五條 分公司行政人事部必須在三日內(nèi)將新聘員工之《員工登記表》傳真至人力資源部備案及核薪。
第二十六條 錄用審批權(quán)限：
1、 分公司財務、倉管、主管級以上人員報分公司負責人審核、總公司相關(guān)部門及人力部會簽，總經(jīng)理核準;
2、 分公司其他員工報分公司負責人核準，人力部備案。
第二十七條 員工檔案須嚴格按照規(guī)定順序裝訂，不得隨意涂改，并妥善保存，裝訂順序為：
1、《員工登記表》 2、學歷證復印件 3、英語等級證復印件
4、資格證書復印件 5、社?？◤陀〖?6、體檢證明
7、《招募面試表》 8、《擔保書》 9、擔保人之戶口本復印件
10、擔保人之單位證明11、擔保人房產(chǎn)證復印件 12、《背景調(diào)查表》
13、《家訪調(diào)查表》 14、《擔保核查表》
第二十八條 《員工登記表》須明確注明起薪日期、所在部門、職位及負責區(qū)域等相關(guān)事項。
第二十九條 分公司行政人事部于每月25日將本月新聘員工個人檔案原件及擔保資料復印件(員工個人檔案復印件、《擔保書》及相關(guān)擔保資料原件留存分公司妥善管理)按順序裝訂，以EMS方式寄至人力資源部檔案管理人員。
第七章 附則
第三十條 本入職管理規(guī)定自 年 月 日起執(zhí)行，同時啟用新表格，舊表格一概作廢。
附：1、《錄用通知書》
2、《員工登記表》
3、《背景調(diào)查表》
4、《家訪調(diào)查表》
5、《擔保核查表》
6、《擔 保 書》
附件一：
錄用通知書
先生/小姐：
一、由于您的品德、學識、能力出眾，已被我公司錄取，熱忱歡迎您加入愛施德公司的行列，成為我們良好的工作伙伴。
二、請于 年 月 日 時間攜帶本通知單及下列各項資料到人力資源部辦理報到手續(xù)，如不能按時報到，請事先與我們聯(lián)絡，否則逾時將由備取人員依次候補。
三、報到應備資料及事項：
1、一寸彩色照片四張(如有社會保險卡，則只需交2張照片)。
2、社會保險卡復印件一份(已辦保險者提供)。
3、身份證復印件一份及原件。
4、最高學歷證原件及復印件各一份(含畢業(yè)證、學位證、英語等級證)由
公司交人才交流中心驗證后退回本人。
5、專業(yè)技術(shù)資格證明復印件一份及原件(專業(yè)人員提供)。
6、體檢證明(公司指定的醫(yī)院)。
7、 辦理擔保手續(xù)，請有固定工作并有愛施德公司所在地常住戶口之擔保人帶身份證、戶口本原件及復印件各一份(人力資源部/分公司行政人事部進行核對后將原件退回)親自到公司簽署擔保書(注：擔保人提供資料經(jīng)查核不實者將被辭退)。
