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篇1

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪組織；細(xì)胞培養(yǎng)；SUI模型

【中圖分類號】R691【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號】1007-8517(2009)10-0125-01

壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率約為1 S%-6O%，多發(fā)生于老年人，因受經(jīng)濟(jì)、宗教、教育程度等因素的影響，其實(shí)際發(fā)生率比統(tǒng)計(jì)發(fā)病率更高。SVl的癥狀嚴(yán)重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動(dòng)造成一定程度的影響，甚至?xí)?yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至家庭和睦。

1臨床資料

注射療法是將藥物、化學(xué)制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內(nèi)口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關(guān)閉尿道內(nèi)口和后尿道的作用，從而達(dá)到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內(nèi)括約肌功能障礙、尿道內(nèi)壓降低同時(shí)尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優(yōu)點(diǎn)在于.以在局部浸潤麻醉下進(jìn)行操作，大多數(shù)患者的手術(shù)均.IJ.以在門診進(jìn)行，適用于老年及不能耐一受大手術(shù)的患者?？谇白⑸浏煼ǖ难芯恐饕性谶x擇不同的注射材料上，理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整，無毒、無免疫原性、無變應(yīng)原性，近期內(nèi)不會(huì)被分解，能長時(shí)間保持其支撐作用。口前使用的材料尚難達(dá)到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。

方法：無菌技術(shù)下獲取SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪墊，消化離心，長期培養(yǎng)的方法獲取脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定其表面分子標(biāo)志。SD大鼠24只分為3組，實(shí)驗(yàn)組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后實(shí)驗(yàn)組將熒光標(biāo)記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)分析。

2結(jié)果

原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達(dá)90%融合,基本上為梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)示 CD29陽性，CD34陰性。神經(jīng)切斷術(shù)后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)檢測，三組手術(shù)前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術(shù)后ALLP明顯降低，且組織學(xué)檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。

3討論

本實(shí)驗(yàn)將熒光金標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標(biāo)記的細(xì)胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細(xì)胞，棕黃色，部分出現(xiàn)一定的方向性，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，說明己有細(xì)胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進(jìn)行細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細(xì)胞。利用消化離心，長期培養(yǎng)的方法可獲取大量的干細(xì)胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。

參考文獻(xiàn)

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篇2

【摘要】

目的： 建立胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、分化及鑒定的方法，探討神經(jīng)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。方法： 取孕14 d胎鼠大腦皮層，吸管吹打機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液，采用無血清培養(yǎng)和胎牛血清誘導(dǎo)分化， 應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其分化的子代細(xì)胞。結(jié)果： 從胎鼠大腦皮層分離的細(xì)胞呈神經(jīng)巢蛋白（Nestin）免疫陽性并能在體外傳代培養(yǎng)，血清誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞可表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原微管相關(guān)蛋白2和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元能表達(dá)突觸的特異性標(biāo)志Synatophymin。結(jié)論： 分離和培養(yǎng)的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Nestin，并且具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】 干細(xì)胞 大腦皮質(zhì) 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley

［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.

［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織只有死亡，沒有再生能力。自從上世紀(jì)90年代初科學(xué)家們分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs）以來，人們相繼從各種動(dòng)物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離、培養(yǎng)了NSCs[1，2] 。NSCs的發(fā)現(xiàn)不僅打破了神經(jīng)元不會(huì)再生的傳統(tǒng)觀念，而且為許多以往難以治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療思路和途徑。2007年6月利用細(xì)胞分離、無血清培養(yǎng)、血清誘導(dǎo)分化及免疫熒光等技術(shù)，證明了本實(shí)驗(yàn)所分離的細(xì)胞群為NSCs，以期為進(jìn)一步使用和研究NSCs奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12、B27、胎牛血清購自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗體、突觸素抗體Snaptophysin購自SIGMA公司，MAP2抗體、GFAP抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為NIKON公司產(chǎn)品。

1.2 NSCs的分離培養(yǎng)[3～5]

成年雌性和雄性SD大鼠各1只，體重220～260 g，雌雄合籠后，檢查陰栓，見陰栓計(jì)為孕0 d；孕14 d時(shí)取胎鼠，在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離獲得胎鼠大腦皮層，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反復(fù)切割組織，再用200目細(xì)胞篩過濾，收集入離心管中，反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分裝入50 ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml。培養(yǎng)條件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d傳代1次。

1.3 NSCs的誘導(dǎo)分化

取第4代傳代培養(yǎng)的NSCs，將其吹打成單細(xì)胞后，以5×104/片細(xì)胞密度種于經(jīng)0.1%多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，培養(yǎng)條件為: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)7 d。

1.4 免疫熒光單標(biāo)法鑒定NSCs及其子代細(xì)胞

1.4.1 Nestin免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞

將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在載玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞

取誘導(dǎo)分化的NSCs的細(xì)胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的形態(tài)學(xué)特征及鑒定

由孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞， 接種后立即在相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈懸浮的圓形狀，邊界清楚，折光性強(qiáng)，絕大部分單個(gè)存在。經(jīng)6～7 d無血清加bFGF培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球狀集落， 95 %以上的NSCs球呈懸浮生長，細(xì)胞增殖旺盛（圖1）。原代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)瓶中可見一些細(xì)胞碎片和一些貼壁的雜細(xì)胞，但經(jīng)傳代后，這些雜質(zhì)均減少甚至消失，且生長狀態(tài)良好。在相差顯微鏡下，NSCs呈球形或橢圓形，大小不一。經(jīng)Nestin免疫熒光染色鑒定顯示神經(jīng)干細(xì)胞球呈紅色熒光（圖2）。

2.2 NSCs的誘導(dǎo)分化及其鑒定

胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、分化及鑒定在NSCs培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即開始貼壁和分化，6 h后即可明顯發(fā)現(xiàn)有突起從團(tuán)塊邊緣長出，24 h后有少數(shù)細(xì)胞分化為有突起的細(xì)胞，以后分化的細(xì)胞逐漸增多，從細(xì)胞球周圍遷移出，呈放射狀排列（圖3）；隨著時(shí)間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網(wǎng)狀，7 d時(shí)在相差顯微鏡下NSCs球周圍可見分化成胞體圓形豐滿的神經(jīng)元樣細(xì)胞和突起粗大的膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。免疫熒光染色顯示，在胎牛血清的誘導(dǎo)分化下NSCs能分化成表達(dá)各種相應(yīng)特異性標(biāo)志的終末細(xì)胞，即表達(dá)MAP2的神經(jīng)元（圖4）、表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖5）；同時(shí)，從NSCs分化而來的神經(jīng)元能表達(dá)突觸素（圖6）。

3 討論

NSCs是指在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的一群細(xì)胞，由于具有廣闊的應(yīng)用前景而受到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域眾多研究者的關(guān)注，在治療惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷頓?。┑确矫嬉讶〉秘S碩的成果[6～8]。

NSCs在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布非常廣泛，本實(shí)驗(yàn)從大腦皮層取材，采用機(jī)械分離法來制備NSCs懸液，實(shí)驗(yàn)效果比較理想。NSCs懸液的制備有酶消化法和機(jī)械分離法，但以酶消化法使用居多。由于在實(shí)際操作中很難從客觀上準(zhǔn)確地把握酶作用的最佳時(shí)間點(diǎn)，往往導(dǎo)致消化不足而不易獲得單細(xì)胞懸液；或消化過度造成細(xì)胞受損而導(dǎo)致細(xì)胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有針對許多神經(jīng)生長因子的受體[9]，當(dāng)采用酶消化法來獲取NSCs時(shí)， 可能會(huì)引起細(xì)胞表面受損而致使一部分受體丟失，而這些受體對于NSCs 維持其干細(xì)胞的未分化狀態(tài)是必需的。所以采用顯微解剖和吸管吹打等機(jī)械分離方法來制備NSCs懸液是神經(jīng)干細(xì)胞分離中較為理想的方法。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)瓶中可見大量的細(xì)胞碎片和一些貼壁的細(xì)胞，但經(jīng)傳代3～5代后，這些雜質(zhì)逐漸減少甚至消失。這主要是由于培養(yǎng)液中所含的bFGF只對NSCs具有促進(jìn)分裂和增殖作用[10，11]，而其他雜細(xì)胞在該培養(yǎng)液中無法生長。因此，原代細(xì)胞中大部分非NSCs會(huì)發(fā)生死亡，而NSCs不僅可以存活，還可以分裂和增殖，形成神經(jīng)干細(xì)胞球，從而經(jīng)過多次傳代后， NSCs可以得到純化。

Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞通過免疫熒光觀察培養(yǎng)的細(xì)胞球均呈Nestin免疫反應(yīng)陽性，提示組成細(xì)胞球的細(xì)胞為NSCs。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。免疫熒光顯示，誘導(dǎo)分化7 d后NSCs可以分化為表達(dá)MAP2的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞，證明了NSCs具有多向分化潛能。同時(shí)，本研究觀察到從NSCs誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元突起上有分化較好的串珠樣排列的膨體，突觸素免疫熒光染色陽性，顯示其已經(jīng)具備接受信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，表明分化的神經(jīng)元能夠合成和運(yùn)輸神經(jīng)遞質(zhì)，行使可能的生理功能[12]。

實(shí)驗(yàn)從孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)具備NSCs的三大特征：Nestin免疫反應(yīng)陽性、分裂增殖能力和多向分化潛能，由此證明了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是NSCs。并且，由血清誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)元具備一定的生理功能，可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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篇3

【摘要】

目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進(jìn)行鑒定、標(biāo)記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測第3代細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達(dá)率；電鏡檢查第3代MSCs超微結(jié)構(gòu)。DAPI標(biāo)記MSCs為下一步進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植示蹤。結(jié)果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達(dá)到80%～90%融合。第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結(jié)構(gòu)清晰，可見細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光。結(jié)論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標(biāo)記MSCs。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞；示蹤劑

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強(qiáng)，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標(biāo)記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑和藥品

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲(chǔ)存液(Sigma 公司)。

1.3 分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細(xì)胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細(xì)胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細(xì)胞融合情況，細(xì)胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細(xì)胞。

1.4 透射電鏡樣品制備

將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個(gè)細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標(biāo)記物檢測

0.25%胰酶消化收獲第3代細(xì)胞，收集1×106個(gè)細(xì)胞，洗滌1次，0～4℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測。檢測時(shí)以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對照混勻，室溫下閉光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細(xì)胞，置于冰上，行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 MSCs標(biāo)記

將無菌的DAPI 儲(chǔ)存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細(xì)胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見MSCs細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細(xì)胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細(xì)胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快，24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長，3～4 d可見長梭形細(xì)胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。

2.3 MSCs的鑒定及標(biāo)記

第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖4。

3 討 論

由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜，細(xì)胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會(huì)，且分離的MSCs貼壁時(shí)間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。

一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標(biāo)志物〔5〕，而MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14。因此，實(shí)驗(yàn)選取MSCs表達(dá)陽性的指標(biāo)CD29、CD44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34和CD45作為鑒定參考指標(biāo)〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進(jìn)行檢測，結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點(diǎn)，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。

DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細(xì)胞無毒性，不改變細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，熒光保持時(shí)間較長。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞，且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等不足。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動(dòng)物細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物體內(nèi)，通過Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于可以終生標(biāo)記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細(xì)胞等不足?；驑?biāo)記法通過基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材，使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報(bào)告基因。但目前，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長、成功率低等困難，而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材又因?yàn)閯?dòng)物來源困難，在國內(nèi)較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標(biāo)記率很高(接近100%)，1 w內(nèi)可維持80%～90%標(biāo)記率。但隨著標(biāo)記時(shí)間的延長，其標(biāo)記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細(xì)胞失去標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高，可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細(xì)胞。采用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標(biāo)記藍(lán)色熒光，提示DAPI 標(biāo)記法敏感性好，標(biāo)記效率高，可應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植的良好標(biāo)記。

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篇4

關(guān)鍵詞：信息技術(shù)；婦幼保健院；政工干部培養(yǎng)

信息技術(shù)是伴隨計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展的，如今信息技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入了發(fā)展的全盛時(shí)期，信息技術(shù)的發(fā)展對人們的生活、學(xué)習(xí)及工作方式產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養(yǎng)工作也不免受到信息技術(shù)發(fā)展的影響，如何準(zhǔn)確地把握信息技術(shù)發(fā)展水平及趨勢對于政工干部培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，科學(xué)利用信息技術(shù)的強(qiáng)大功能來提高政工干部培養(yǎng)的質(zhì)量，是所有企事業(yè)單位需要思考的問題，婦幼保健院也不例外。

一、信息技術(shù)發(fā)展對婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的影響

1.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)提出了更高的要求

信息技術(shù)的發(fā)展使得信息化素質(zhì)成為政工干部的基本素質(zhì)之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質(zhì)是指主體所擁有的各種信息品質(zhì)，包括信息智慧、信息道德、信息意識(shí)、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內(nèi)容。信息化素質(zhì)能讓政工干部跟上時(shí)展的潮流，掌握最新的信息技術(shù)，也能讓政工干部認(rèn)識(shí)到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質(zhì)量，培養(yǎng)政工干部終身學(xué)習(xí)意識(shí)。婦幼保健院作為醫(yī)療體系的一部分，一些醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質(zhì)才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術(shù)的發(fā)展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質(zhì)，學(xué)好信息知識(shí)、掌握信息技能的同時(shí)，還要學(xué)習(xí)政工理論知識(shí)、醫(yī)療專業(yè)知識(shí)及人文社科知識(shí)等，培養(yǎng)政工干部的領(lǐng)導(dǎo)管理能力、溝通交流能力等。

2.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)培養(yǎng)提供了新的條件

信息技術(shù)的發(fā)展改變了傳統(tǒng)的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時(shí)間，使個(gè)人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養(yǎng)創(chuàng)造了有利的條件。首先，政工干部學(xué)習(xí)、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養(yǎng)課程中使用各種計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)方式，它使課程內(nèi)容更加生動(dòng)有趣，能更好地激發(fā)政工干部的學(xué)習(xí)興趣；依靠網(wǎng)絡(luò)教學(xué)的方式還可以讓政工干部充分利用網(wǎng)上豐富的信息資源，相互交流學(xué)習(xí)；此外政工干部還可以合理安排自己的學(xué)習(xí)時(shí)間，選擇自己的學(xué)習(xí)方式，培養(yǎng)方式更加個(gè)性化。其次，政工干部利用信息的方式發(fā)生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質(zhì)材料，現(xiàn)在政工干部閱讀的載體擴(kuò)展到網(wǎng)絡(luò)信息，從文字?jǐn)U展到圖像、聲音、三維等；在表達(dá)方式上實(shí)現(xiàn)了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復(fù)制或者刪減其他文件；在計(jì)算方式上也不再需要人工計(jì)算，利用計(jì)算機(jī)準(zhǔn)確又迅速減輕了政工干部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的負(fù)擔(dān)。

3.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)培養(yǎng)帶來的問題

首先，信息鴻溝現(xiàn)象比較嚴(yán)重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現(xiàn)代信息技術(shù)方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養(yǎng)課程增加了不小的難度。其次，網(wǎng)絡(luò)信息量過于龐大。信息技術(shù)的發(fā)展使得，各種信息都能在網(wǎng)絡(luò)上迅速傳播，過量的信息會(huì)使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴(yán)重影響政工干部的培養(yǎng)工作。

二、提高婦幼保健院政工干部培養(yǎng)質(zhì)量的對策

1.定期完善政工干部培養(yǎng)方案

信息技術(shù)的發(fā)展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養(yǎng)緊跟時(shí)代的步伐就必須根據(jù)時(shí)代的變化對培養(yǎng)方案和教學(xué)計(jì)劃進(jìn)行全面的調(diào)整和修訂，但是不能改變的是要始終強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)信息化素質(zhì)的重要性。培養(yǎng)方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)課程專題、教師師資、教學(xué)材料和教學(xué)組織形式等，要突出強(qiáng)調(diào)信息化素質(zhì)的地位。

2.精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)的專題體系

婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的基本平臺(tái)就是課程專題，怎樣設(shè)計(jì)合理的課程專題也成為政工干部培養(yǎng)工作的難題，可以明確的是必須要依據(jù)信息技術(shù)的發(fā)展對各類政工干部知識(shí)能力素質(zhì)的客觀要求來建立課程專題體系，同時(shí)也要根據(jù)不同教學(xué)對象的性質(zhì)、層次和類型做出調(diào)整。要根據(jù)政工干部的培養(yǎng)目標(biāo)確定專題的類別和課時(shí)比例，各類專題都有圍繞解決新時(shí)期思想政治教育工作來設(shè)計(jì)，專題設(shè)置和內(nèi)容都要做到內(nèi)容精干、素材新穎、實(shí)在管用，不僅要包括信息化知識(shí)和技術(shù)的課程，還要有其他方面的課題。

3.打造政工干部培養(yǎng)的環(huán)境條件保障體系

婦幼保健院可以從以下幾個(gè)方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學(xué)設(shè)施設(shè)備，包括計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)、多功能教室等。其次，建設(shè)多樣的信息化教學(xué)信息資源子系統(tǒng)，例如數(shù)字化圖書館信息資源、課程網(wǎng)絡(luò)信息資源、教學(xué)管理信息資源等。

總之，為了讓信息技術(shù)的發(fā)展更好地為婦幼保健院的政工干部培養(yǎng)工作服務(wù)，需要站在全局的高度將信息技術(shù)理論和方法應(yīng)用到培養(yǎng)的全過程中，需要對政工干部培養(yǎng)的形式、內(nèi)容、方法進(jìn)行深刻變革，以提高政工干部培養(yǎng)的效率，全面提高政工干部信息化素質(zhì)培養(yǎng)的質(zhì)量和效益。

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【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;誘導(dǎo)分化;成骨細(xì)胞

【中圖分類號】R414.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號】1005-0515(2010)009-0010-01

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一類具有分化潛能的成體干細(xì)胞,在特定條件下可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞,被認(rèn)為骨組織工程中的最佳種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離成年大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,定向成骨分化,并檢測細(xì)胞表面標(biāo)志、堿性磷酸酶活性和細(xì)胞礦化作用。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,體重150~180 g ,由浙江大學(xué)華家池動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技術(shù)有限公司),B一甘油磷酸納(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),維生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC單克隆抗體(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)親和純化抗體(武漢博士德公司)

2 方法

2.1 BMSCs的分離和培養(yǎng):成年wistar大鼠麻醉后處死,無菌條件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔.制成骨髓單細(xì)胞懸液。接種于培養(yǎng)皿中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)。于72h半量更換培養(yǎng)液,以后每3d半量換液1次。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行分化培養(yǎng).對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測rBMSCs的表面標(biāo)志: 取生長良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml細(xì)胞懸液以1ml接種于蓋玻片,待細(xì)胞單層融合至65%左右時(shí),細(xì)胞爬片采用SP檢測。

2.3 rBMSCs成脂向誘導(dǎo)分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養(yǎng),貼壁24h后換用成脂誘導(dǎo)劑,取誘導(dǎo)30d后的細(xì)胞進(jìn)行蘇丹Ⅳ染色。

2.4 rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養(yǎng),貼壁24h后換用成骨誘導(dǎo)劑,取誘導(dǎo)15d、30d后的細(xì)胞進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色。

3 結(jié)果

3.1 原代培養(yǎng)的BMSCs接種24h后,即出現(xiàn)零星貼壁細(xì)胞。72h后開始增殖,生長良好,貼壁較均勻。BMSCs呈紡錘狀,有突起。約10d時(shí),細(xì)胞匯合成片,其融合率可達(dá)到80%~90%,有接觸抑制現(xiàn)象。

3.2 rBMSCs表達(dá)出許多的非特異性的表面標(biāo)志物。DAB顯色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。

3.3 rBMSCs脂向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化:扁平,多為原盤狀,可見細(xì)胞突起。細(xì)胞誘導(dǎo)10d后胞漿中出現(xiàn)致密的黑色點(diǎn)狀物,被大量的“小白點(diǎn)”狀的脂滴前體分割。14d后,出現(xiàn)少量高折光性脂滴,隨著時(shí)間推進(jìn),不斷增多并形成大脂滴。綠色濾光片下可見清晰的脂滴;蘇丹Ⅳ染色顯示紅色脂滴。

3.4 rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中,誘導(dǎo)15d就有較多高折光性小顆粒沉積,并可見局部融合,30d時(shí),可見大量結(jié)節(jié),幾乎覆蓋整個(gè)細(xì)胞層。

4 討論

骨髓基質(zhì)細(xì)胞又被稱為“間充質(zhì)干細(xì)胞”或“骨源性干細(xì)胞”。近年來研究發(fā)現(xiàn)還可以分化為星形膠質(zhì)、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元,所以又稱為多潛能成體干細(xì)胞。分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有多種方法:免疫磁珠分離法[1]和流式細(xì)胞儀法[2]因費(fèi)用高、需骨髓量大、操作復(fù)雜而較少應(yīng)用。全骨髓法[3]即貼壁細(xì)胞分離法雖方法簡單但所獲細(xì)胞純度不高;密度梯度離心法[4]是根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重不同離心分離培養(yǎng),簡單易行,所獲得的細(xì)胞純度較高。

本實(shí)驗(yàn)選用密度梯度離心法分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過3~5代的傳代,細(xì)胞形態(tài)趨于一致;免疫熒光檢測顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。于文獻(xiàn)報(bào)道[5]相一致。雖然這些不是特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物,但可以用以鑒別參考。

多向分化潛能是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞最重要的生物學(xué)特性[6~7]。本研究表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞在體外誘導(dǎo)的情況下,既可以誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞,又可以誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞。因此,體外誘rBMSCs骨向分化可以很好地模擬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向骨祖細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞分化的整個(gè)過程,是體外研究成骨功能及骨代謝的理想細(xì)胞生物模型。

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篇6

【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）對乙醇損傷大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞保護(hù)的作用和機(jī)制。方法采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，以不同濃度的SS-d對肝細(xì)胞保護(hù)，檢測培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性和肝細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法檢測肝細(xì)胞存活率。結(jié)果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明顯改善肝細(xì)胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，對肝細(xì)胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明顯的抑制作用。結(jié)論SS-d對乙醇損傷大鼠肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SS-d清除自由基、抑制質(zhì)脂過氧化作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乙醇 肝細(xì)胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護(hù)作用 機(jī)制

隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對肝臟的損害日漸突出。了解酒精對肝損傷的機(jī)制，篩選有效預(yù)防和治療酒精性肝損傷的藥物應(yīng)用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復(fù)方對酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究和報(bào)道比較多，單味制劑報(bào)道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強(qiáng)。整體水平研究表明柴胡皂苷對酒精性肝損傷有預(yù)防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究柴胡有效成分SS-d對乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1 器材與方法

1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。

1.4 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結(jié)締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細(xì)胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>85%，按1 ×109個(gè)·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.5 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立將含肝細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板，設(shè)正常對照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個(gè)劑量組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測定ALT活性，MTT法測定肝細(xì)胞存活率。

1．6 MTT法選擇SS-d的實(shí)驗(yàn)濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設(shè)空白對照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結(jié)晶，檢測波長為492 nm的光密度值，計(jì)算藥物不同稀釋濃度下細(xì)胞的存活率。

1.7 SS-d對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取培養(yǎng)72 h肝細(xì)胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時(shí)SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，收集肝細(xì)胞檢測MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測定肝細(xì)胞的存活率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 乙醇對原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細(xì)胞，對細(xì)胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細(xì)胞存活率呈進(jìn)行性降低，反映肝細(xì)胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細(xì)胞損傷模型。見表1。表1 不同濃度乙醇對肝細(xì)胞ALT水平及細(xì)胞存活率的影響 與空白對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 實(shí)驗(yàn)濃度的選擇SS-d不同濃度時(shí)細(xì)胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細(xì)胞毒性作用，應(yīng)選擇對細(xì)胞生長無明顯影響即肝細(xì)胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度。見表2。表2 不同濃度SS-d對肝細(xì)胞存活率的影響與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d對乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞損傷明顯，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護(hù)后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細(xì)胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細(xì)胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。見表3。表3 SS-d對乙醇損傷肝細(xì)胞ALT，MDA，GSH-px水平與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 討論

大量研究表明，乙醇對肝細(xì)胞損傷是通過自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時(shí)產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細(xì)胞外，可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動(dòng)性失常，大量肝內(nèi)酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細(xì)胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細(xì)胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，才能保護(hù)肝細(xì)胞，恢復(fù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用［7，8］。但對單體SS－d保肝作用研究報(bào)道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上對SS-d保肝作用機(jī)制進(jìn)行探討。本研究顯示，模型組肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯升高，肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細(xì)胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細(xì)胞氧化損傷；給予SS－d保護(hù)后，和模型組比較，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細(xì)胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對乙醇損傷肝細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能是：①SS-d能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；②穩(wěn)定肝細(xì)胞膜系統(tǒng)，提高膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，防止肝細(xì)胞損傷和壞死。

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篇7

2010年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予英國生理學(xué)家羅伯特•愛德華茲，以表彰他在“體外受精”技術(shù)領(lǐng)域做出的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。

1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創(chuàng)了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時(shí)至今日，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被全世界絕大多數(shù)國家承認(rèn)，堪稱醫(yī)學(xué)史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。

被譽(yù)為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學(xué)教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術(shù)上講非常簡單，就是把卵細(xì)胞中DNA去掉，然后將體細(xì)胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個(gè)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險(xiǎn)?！?/p>

本文以此熱點(diǎn)問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進(jìn)行單項(xiàng)預(yù)測。預(yù)測材料及其涉及的知識(shí)、試題如下：

1．試管嬰兒

【知識(shí)鏈接】要做好有關(guān)“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識(shí)外，還要掌握“試管嬰兒”技術(shù)的有關(guān)知識(shí)?！霸嚬軏雰骸奔夹g(shù)是通過將不孕夫婦的和卵細(xì)胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養(yǎng)使其發(fā)育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內(nèi)使其發(fā)育成胎兒。

體外受精步驟包括：的采集與培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)、體外受精等操作技術(shù)。具體過程如下圖:

哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程大體概括如下圖：

例1 下列關(guān)于關(guān)試管嬰兒的說法，不正確的是（）

A. 從良種母牛體內(nèi)采集的卵母細(xì)胞都需要進(jìn)行體外培養(yǎng)

B. 從良種公牛采集的需進(jìn)行獲能處理

C. 早期胚胎移植的意義在于提高優(yōu)良母畜的繁殖率

D. 早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至原腸胚時(shí)期的胚

解析：本題考查了試管嬰兒的相關(guān)知識(shí)。根據(jù)體外受精和胚胎發(fā)育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至囊胚時(shí)的胚。

答案：D

例2 據(jù)2008年1月17日《干細(xì)胞》雜志報(bào)道，某科學(xué)家使用了進(jìn)行試管受精的年輕女性捐獻(xiàn)的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞，成功克隆出了5個(gè)人體胚胎，進(jìn)而可以開發(fā)出有研究價(jià)值的干細(xì)胞。請回答：

（1）上述過程中主要應(yīng)用到的兩項(xiàng)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)為；若將某經(jīng)過修飾的基因?qū)肫渲械牟糠峙咛ジ杉?xì)胞，常用的方法是。

（2）在使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常需要加入等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于一定的氣體環(huán)境，所需要的氣體主要有 。

（3）科學(xué)家欲進(jìn)行胚胎分割移植，則應(yīng)該選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，然后用分割針進(jìn)行分割。

答案：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植顯微注射技術(shù)（法）

（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚

2．克隆人研究

【知識(shí)鏈接】克隆人的基本原理是動(dòng)物細(xì)胞核的全能性，包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。其基本過程為：

細(xì)胞核移植技術(shù)中注入去核卵母細(xì)胞中的不是供體細(xì)胞核，而是整個(gè)細(xì)胞，伴隨著兩細(xì)胞融合，體現(xiàn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有一定的流動(dòng)性。該技術(shù)形成重組細(xì)胞繼而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，體現(xiàn)了細(xì)胞核的全能性而非動(dòng)物細(xì)胞的全能性。

例3 下圖為克隆人的示意圖，據(jù)圖回答：

（1）圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有、和

等。

（2）下列有關(guān)胚胎移植的敘述正確的有（）

A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子

B.只有供、受體生理環(huán)境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續(xù)發(fā)育

C.供體和受體要進(jìn)行免疫檢查，防止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)

D.不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，人的胚胎移植最好在四個(gè)細(xì)胞階段進(jìn)行

（3）圖中兩個(gè)嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。

（4）使用培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常要加入等天然成分，除了保證被培養(yǎng)細(xì)胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環(huán)境中，還需要保證細(xì)胞生活所需的；早期胚胎發(fā)育在階段以前的細(xì)胞是全能細(xì)胞。

（5）圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過程中，必須用處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。干細(xì)胞形成組織、器官必須要進(jìn)行 和 。

（6）在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞能否獲得動(dòng)物器官?

。為什么？

解析：（1）該圖利用了細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割移植等技術(shù)。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態(tài)，才能保證胚胎的正常發(fā)育。（3）克隆過程說明動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：無菌、無毒的環(huán)境；營養(yǎng)物質(zhì)（合成培養(yǎng)基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環(huán)境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個(gè)細(xì)胞。（6）胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下一般只能增殖進(jìn)行細(xì)胞分裂，不能發(fā)生細(xì)胞分化。

答案：（1）核移植 胚胎移植 細(xì)胞培養(yǎng)（另外寫細(xì)胞融合、胚胎分割也對，寫了三個(gè)則給滿分）（2）ABD（3）動(dòng)物體細(xì)胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細(xì)胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以增殖而不發(fā)生分化

3．生物技術(shù)中的倫理問題

【知識(shí)鏈接】生物技術(shù)引發(fā)的倫理問題包括克隆技術(shù)引發(fā)的倫理問題、試管嬰兒引發(fā)的倫理問題、基因檢測引發(fā)的倫理問題。中國政府對于克隆技術(shù)的態(tài)度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態(tài)度，中國衛(wèi)生部的規(guī)定是實(shí)施體外受精、胚胎移植及衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部的批準(zhǔn)證書。

例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：

（1）圖中①為 細(xì)胞，過程A是目前實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)稱為 。

（2）圖中③能誘導(dǎo)分化出神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，其根本原因是 的結(jié)果。這樣培育得到的組織器官進(jìn)行自體移植的最大好處是 。

（3）若應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因?qū)虢Y(jié)構(gòu)④中的

，原因是這些細(xì)胞 。

（4）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，緩沖溶液中必須加入的物質(zhì)有：、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。

（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克?。纯寺∪耍┠兀空埬銓懗鲆粭l理由： 。

解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細(xì)胞的核與卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組， 形成重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)得到囊胚，取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)得到不同組織器官，可用于進(jìn)行自體移植，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

答案：（1）次級卵母（卵） 核移植

（2）基因選擇性表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生排異（免疫排斥）反應(yīng)

（3）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá)

篇8

【關(guān)鍵詞】 消化液； 添加物； 牛胚胎干細(xì)胞； 克隆效率

胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是具有全能性的哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞或原始細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在分化抑制的培養(yǎng)條件下，可以未分化狀態(tài)無限增殖。近年來有關(guān)牛類ES細(xì)胞分離與克隆的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展[1-2]。筆者為探討添加物和消化液對牛胚胎干細(xì)胞克隆效率的影響，通過從牛鮮胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）中分離獲得牛類ES細(xì)胞后進(jìn)行克隆，在培養(yǎng)細(xì)胞中添加胰島素生長因子和消化液，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 牛胚采集 在自然期，對健康經(jīng)產(chǎn)黑白花奶牛母進(jìn)行人工受精后68 d經(jīng)非手術(shù)方法從牛子宮取胚胎。將待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 鹽酸利多卡因麻醉。按規(guī)定方法在沖洗兩側(cè)子宮角。沖出的胚胎要在立體顯微鏡下檢查。在100倍實(shí)體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調(diào)、分裂球的大小、均勻度、細(xì)胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等[3-4]。

1.2 溶液配制 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的血清及各種細(xì)胞因子）；細(xì)胞基礎(chǔ)消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基礎(chǔ)上，兩者濃度有所調(diào)整）。

1.2.1 飼養(yǎng)層制備 選取新生健康黑白花牛犢制備成纖維細(xì)胞，取3代內(nèi)對數(shù)生長期MEF， 終濃度10μg/ml 絲裂霉素C處理 3.5 h， D-PBS充分洗滌，消化細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，種植在經(jīng) 0.1%明膠包被的4孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用，用前更換成胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 胚胎處理和胚胎培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室溫下培養(yǎng)牛胚胎及ES細(xì)胞。

1.2.3 ICM初次傳代 將ICM細(xì)胞體外培養(yǎng)6～7 d后，當(dāng)細(xì)胞繁殖到一定數(shù)目時(shí)，選擇未分化的細(xì)胞進(jìn)行傳代。操作如下：用玻璃針剝離覆蓋在ICM表面的滋養(yǎng)層細(xì)胞后挑出ICM，用PBS洗滌液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中處理后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15%的血清培養(yǎng)液中，制備細(xì)胞團(tuán)懸混液。培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 牛ES細(xì)胞繼代克隆 ICM細(xì)胞培養(yǎng)35 d后，飼養(yǎng)層表面可出現(xiàn)類似ES細(xì)胞的集落。棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌集落，再用玻璃針剝脫隆起明顯、排列緊密的ES細(xì)胞集落，再用毛細(xì)吸管將集落移入培養(yǎng)液中。

1.3 研究方法 在DMEM培養(yǎng)基中加入10 ng/ml的IGF（設(shè)為IGF組）觀察牛ES細(xì)胞的克隆結(jié)果與未加IGF（設(shè)為對照組）時(shí)做比較，在離散ICM和ES集落時(shí)，分別用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A組）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B組），作用時(shí)間控制為2 min，溫度37 ℃。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

不同條件對牛ES細(xì)胞克隆的影響情況，具體結(jié)果見表1。

3 討論

胚胎干細(xì)胞具有全能性，能再體外條件下分化為各器官系統(tǒng)細(xì)胞，亦可在分化抑制的情況下進(jìn)行未分化狀態(tài)克隆，胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、嵌合體的制作和克隆動(dòng)物的生產(chǎn)，目前有關(guān)牛胚胎克隆的研究取得了重大進(jìn)展[4-5]。為探討不同條件對牛ES細(xì)胞克隆的影響，筆者探討了在不同濃度消化液及在胰島素生長因子作用下，牛ES細(xì)胞克隆的變化。牛ES細(xì)胞在以上配置的培養(yǎng)液中培養(yǎng)形成ES細(xì)胞集落胚數(shù)/枚ES 2枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)2代。在培養(yǎng)液中加入10 ng/ml的IGF牛ES細(xì)胞集落胚數(shù)為3枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)4代，可見IGF對牛ES細(xì)胞克隆有促進(jìn)作用。在ICM細(xì)胞與ES細(xì)胞分離時(shí)用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液處理2 min，形成ES細(xì)胞集落胚數(shù)/枚ES 9枚細(xì)胞最大傳代數(shù)4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分離牛ES細(xì)胞集落胚數(shù)為8枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)4代。因此，在分離ICM細(xì)胞和ES細(xì)胞時(shí)注意，選擇適當(dāng)濃度的消化液，且作用時(shí)間不宜過長[6-8]。通過本實(shí)驗(yàn)可得出在進(jìn)行牛ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可利用一定的添加物促進(jìn)ES細(xì)胞克隆，促進(jìn)其繁殖，而對于分離ICM和ES細(xì)胞的消化液，須嚴(yán)控其濃度和作用時(shí)間。

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