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關(guān)鍵詞 基因工程；研究進展；原理；應(yīng)用
中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2012）10-0045-02
20世紀70 年代以來，基因工程技術(shù)在世界范圍內(nèi)蓬勃興起，至今已在多個學(xué)科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。基因工程是一項能夠較好地服務(wù)于人類社會的工程技術(shù)，該技術(shù)通過改變生物的遺傳組成，增加生物的遺傳多樣性，由此賦予新型轉(zhuǎn)基因生物的表型特征[1]。目前，以基因重組和克隆技術(shù)為代表的生物技術(shù)正以日新月異的速度迅猛發(fā)展。
1 基因工程原理
基因工程（genetic engineering）以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)、以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段進行的研究，又稱為DNA重組或分子克隆。通過體外重組，基因工程將不同來源的基因?qū)胧荏w細胞，在體細胞內(nèi)實現(xiàn)基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。這種技術(shù)是按照人們的意愿將某一生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M行切割，然后與載體DNA分子連接起來，一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細胞中[2-3]。對于受體細胞而言，與載體相連的DNA分子就屬于外源物質(zhì)也稱為重組體。重組體導(dǎo)入到受體細胞之后就可以進行正常的復(fù)制和表達，從而獲得新物種。一般來說，載體的選擇對能否成功進入受體細胞并且復(fù)制和表達起著很重要的作用，載體進入受體細胞應(yīng)該以不影響受體細胞正常生長為基本原則。這種技術(shù)克服了遠緣雜交的不親和，為改造生物提供了有效的手段。
2 基因工程的應(yīng)用
2.1 植物基因工程技術(shù)在中草藥研發(fā)中的應(yīng)用
2.1.1 提高藥用植物的有效成分含量。目前，學(xué)者在鐵皮石斛上應(yīng)用了基因工程技術(shù)，以提高其有效成分的含量。由于人工合成成本很高，若能夠通過基因工程技術(shù)提高石斛堿的含量，會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。魏小勇等[4]以鐵皮石斛種胚原球莖為研究材料，定向誘導(dǎo)后獲得穩(wěn)定的石斛堿突變體，分析突變體的表達效果，并以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，構(gòu)建鐵皮石斛差減cDNA文庫，獲得差異表達mRNA反義基因。通過構(gòu)建相應(yīng)載體轉(zhuǎn)化石斛，來分析轉(zhuǎn)基因石斛中石斛堿的變化，通過篩選反義基因來確定石斛堿功能基因。將類似鐵皮石斛的稀缺植物上應(yīng)用基因工程技術(shù)，可為中草藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)[5]。
2.1.2 提高藥用植物的抗病性和抗逆性。一般對藥用植物都是采用大規(guī)模的種植，由此才能滿足市場需求。應(yīng)用植物基因工程技術(shù)可解決栽培過程中的病害問題。如種植培養(yǎng)出的抗病毒、抗蟲害品種，可增強植物對病害的抵抗能力，不僅能降低植物病害的發(fā)生，還能減少由于使用農(nóng)藥而帶來的污染[6]。Pilon-Smit et al[7]將SacB基因?qū)霟煵?，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱抗寒特性。我國學(xué)者也開展了植物基因工程技術(shù)的研究和應(yīng)用，并取得了顯著的成果。賀 紅等[8]以枳殼實生苗上胚軸為研究材料，為獲得轉(zhuǎn)柑桔衰退病病毒外殼蛋白基因的植株，其采用了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。有學(xué)者還利用Ti 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得了多種抗病毒的植物，如抗黃瓜花葉病毒（CMV）的番茄和抗甜菜壞死黃脈病毒（BNYV）的甜菜等[9]。
2.2 基因工程在植物性食品脫敏中的應(yīng)用
基因工程可以將目的基因?qū)胧荏w細胞，也可以改變內(nèi)源基因，只要找到需要刪除的基因即可。過敏反應(yīng)具有反應(yīng)迅速的特點，過敏原種類也很多。因此，防止發(fā)生過敏反應(yīng)也很困難?；蚬こ炭梢灾苯幼饔糜谶^敏源頭，即改變內(nèi)源基因使編碼的蛋白質(zhì)失去致敏性。也可以通過基因工程方法處理食品及其原料可降低其致敏性，從而降低過敏病人的不良反應(yīng)。反義技術(shù)可消除植物中內(nèi)源基因，使致敏基因沉默，從而降低植物性食品致敏性[10]。
2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用
隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們可以根據(jù)意愿改良動物品種，結(jié)合基因技術(shù)原理的應(yīng)用，由此實現(xiàn)重要的經(jīng)濟價值。在畜牧業(yè)生產(chǎn)上，主要是用于遺傳改良，加速動物育種。轉(zhuǎn)基因可以定向培育并保存物種的優(yōu)良性狀，并能加快其積累和保存的步伐。在大量的轉(zhuǎn)基因動物中選出符合人們預(yù)想的轉(zhuǎn)基因動物，利用優(yōu)良動物品種的體細胞作核供體克隆動物，用于大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于家畜上，在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)入結(jié)合特異抗原抗體基因，可生產(chǎn)出具有抗多種疾病性能的動物[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的科技含量較高，但在實驗室內(nèi)也能實現(xiàn)動物育種。在動物雜種優(yōu)勢利用方面，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可加速動物育種的進程，增強選育種畜性狀的穩(wěn)定性，降低育種的時限并提高效率[11]。
2.4 基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用[12-14]
2.4.1 糖類的改良。淀粉是一種多糖，通過對酶的調(diào)控可控制其含量水平，ADPP葡萄糖焦磷酸酶、淀粉合成酶和分枝酶是高等植物的淀粉合成酶。將淀粉系土壤大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)移到馬鈴薯上，可增加馬鈴薯的淀粉含量[12]。這種基因可表達ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，使馬鈴薯淀粉含量增加近20%[15]。目前，利用植物基因工程技術(shù)改善食品的風(fēng)味已取得重大的進展。Monsanto公司開發(fā)出轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，新型馬鈴薯產(chǎn)品的淀粉含量較傳統(tǒng)品種平均提高了20%～30%，油炸后的產(chǎn)品具有更好的構(gòu)質(zhì)和風(fēng)味，并且油味和吸油量都較少[16]。
2.4.2 改善發(fā)酵食品風(fēng)味。發(fā)酵食品具有工業(yè)經(jīng)濟效益，其品質(zhì)將直接影響效益。但是在該領(lǐng)域不能廣泛地應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物，否則不能達到定向改造微生物性狀的目的。因此，選擇的微生物將決定發(fā)酵食品風(fēng)味。隨著分子生物學(xué)的興起，在分子水平上可利用DNA 重組、RNA 干擾及基因敲除等基因工程技術(shù)來構(gòu)建所需的基因工程菌株[17]。
例如，在啤酒和醬油的生產(chǎn)工藝中可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善產(chǎn)品的風(fēng)味。在釀造醬油的過程中，氨基酸的生成量對整體風(fēng)味起決定性的作用，參與該反應(yīng)的羧肽酶和堿性蛋白酶的基因已克隆并成功轉(zhuǎn)化到菌株中，羧肽酶的活力可大幅提高13倍，堿性蛋白酶的活力可提高5倍，從而提高氨基酸的生成量[18]。為滿足不同食品的需要，在醬油的釀造工藝中可使用工程菌株，由此降低醬油的色度和口味。啤酒中含有一種叫雙乙酰的物質(zhì)，雙乙酰是啤酒酵母細胞產(chǎn)生的α-乙酰乳酸經(jīng)非酶促的氧化脫羧反應(yīng)自發(fā)產(chǎn)生的，當(dāng)雙乙酰含量超過風(fēng)味閾值（0.02~0.10 mg/L）時，就會大大降低啤酒的口感，產(chǎn)生餿酸味，進而影響經(jīng)濟效益。為改善啤酒的風(fēng)味，可采用α-乙酰乳酸脫羧酶去除雙乙酰。研究表明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼α-乙酰乳酸脫羧酶的基因克隆到啤酒酵母中進行表達[15]，可以有效降低啤酒中的雙乙酰含量。基于基因工程原理，還可將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于制取其他產(chǎn)品[19]。
3 展望
目前，基因工程技術(shù)已滲透到人類生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域，其以巨大的生命力發(fā)揮重大的影響，一些實驗室技術(shù)和成果不斷地得到應(yīng)用，也將使地球的生物圈變得更加豐富多彩[20]。如今基因工程技術(shù)在給人類帶來利益的同時，對于疾病的治療方面也有了巨大突破。盡管基因工程技術(shù)給人類帶來了巨大的利益和便利，但同時也應(yīng)該思考轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題，這是對基因工程未來發(fā)展的最大挑戰(zhàn)[21-22]。
4 參考文獻
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筆者根據(jù)課標要求，結(jié)合考綱和近年高考考點將近年基因工程考點總結(jié)如下。
一、 基因工程的基礎(chǔ)知識
基因工程的理論鋪墊――分子生物學(xué)發(fā)展：
① 艾弗里證明了DNA是遺傳物質(zhì)。
② 沃森和克里克證明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。
③ 尼侖貝格破譯了遺傳密碼。
二、 酶切
基因工程選擇限制性內(nèi)切酶作為工具，主要是因為它具有比一般酶更高的專一性。由于其具有較高的專一性，因此在基因工程的具體操作中如何選擇限制性內(nèi)切酶是高考的重點考察內(nèi)容。
1. 限制酶的特異性
例1 判斷用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸是否可行？_____。
答案 不可行
解析 限制酶的專一性非常強，其特異性表現(xiàn)在三個方面：識別DNA、識別特定序列（回文）、切割特定位點磷酸二酯鍵。由于煙草花葉病毒是RNA病毒，所以限制酶不能識別RNA。
另外要特別注意限制酶切割以后的結(jié)果，磷酸二酯鍵斷裂，暴露出新的磷酸基團。
2. 限制酶的選擇
正確選擇限制酶是基因工程中一件非常重要的任務(wù)。限制酶的選擇應(yīng)當(dāng)遵循以下一些原則：不破壞目的基因；不破壞標記基因；目的基因和運載體上都有限制酶的切割位點。當(dāng)然也要注意用一種限制酶和兩種限制酶切割的區(qū)別。
例2 與只使用EcoR I相比較，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止_________
______________________。
答案 質(zhì)粒和含目的基因的外源DN段自身環(huán)化
解析 基因工程中目的基因和質(zhì)?？梢杂猛环N酶切，也可以用兩種酶切，若用一種酶切，質(zhì)粒只要切一個切口，目的基因需要切兩個切口；若用兩種酶切，質(zhì)粒要切兩個切口，目的基因也需要切兩個切口。一種酶切出的4個切口都相同，所以有多種連法，兩種酶切出的質(zhì)粒和目的基因上的4個切口兩兩相同，因此可以防止自身環(huán)化。
3. 同尾酶
限制酶種類多樣，一些酶之間關(guān)系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ識別不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它們切出的末端可以連接，被稱為同尾酶。
例3 已知限制酶I的識別序列和切點是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是―GATC―。根據(jù)下圖示判斷下列操作正確的是（ ）
A. 質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割
D. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割
答案 A
三、 連接
1. 連接物類型
經(jīng)過限制酶切割過以后，暴露出的相同的黏性末端可以自動連接，考生同時需要考慮：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因兩端的兩個黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；質(zhì)粒上的兩個黏性末端。綜合以上結(jié)論，連接產(chǎn)物的類型可能就比較多，如目的基因-目的基因連接物、目的基因-運載體連接物、運載體-運載體連接物、其他DN段-運載體連接物、目的基因自連、運載體自連，若用同一種酶切時后兩種連接物不存在。
2. 連接酶
下表簡要總結(jié)了基因工程中常見酶的特性差異。
例 PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為_____________
___________________。
答案 DNA聚合酶只能將單核苷酸連接到雙鏈DN段的引物鏈上
解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么連接酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因為連接酶必須將兩段DNA相連。RNA聚合酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因為RNA聚合酶雖然不要引物，但其不能催化T參與反應(yīng)，只能利用U。雖然這些酶都是催化磷酸二酯鍵，但它們作用的底物差異較大，所以一定要注意辨析。
以上主要介紹了基因工程的三種操作工具，這些內(nèi)容當(dāng)然是高考的重點和熱點。除此之外有些內(nèi)容也應(yīng)當(dāng)給予一定關(guān)注，如：目的基因的獲??；目的基因的擴增（PCR）；土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因的導(dǎo)入；重組質(zhì)粒的篩選；目的基因的檢測；轉(zhuǎn)基因生物的安全性；轉(zhuǎn)基因生物的利用等問題。
鞏固訓(xùn)練
1. 目前人類利用基因工程的方法成功培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，以下說法正確的是
（ ）
A. 標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因
B. 抗蟲基因?qū)朊藁ㄈ~肉細胞后，可通過傳粉、受精的方法，使抗蟲性狀遺傳下去
C. 蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白基因與質(zhì)粒結(jié)合后直接進入棉花的葉肉細胞表達
D. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉經(jīng)過種植，棉鈴蟲不會產(chǎn)生抗性，這樣可以有效消滅棉鈴蟲
2. 下圖四種質(zhì)粒含有E1和E2兩種限制酶的識別，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四環(huán)素的抗性基因。
（1） 將兩端用E1切開的Tcr基因與用E1切開的質(zhì)粒X-1混合連接，連接后獲得的質(zhì)粒類型有______。（可多選）
A. X-1 B. X-2
C. X-3 D. X-4
（2） 若將上圖所示X-1、X-2、X-3、X-4四種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，然后分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)上均不能生長的大腸桿菌細胞類型有____________、____________。
（3） 如果X-1用E1酶切，產(chǎn)生850對堿基和3 550對堿基兩種片段：那么質(zhì)粒X-2（Tcr基因的長度為1 200對堿基）用E2酶切后的片段長度為______對堿基。
（4） 若將外源的Tcr基因兩端用E2切開，再與用E2切開的X-1混合連接，并導(dǎo)入大腸桿菌細胞，結(jié)果顯示，含X-4的細胞數(shù)與含X-1的細胞數(shù)之比為13，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________
________________________。
3. 下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點，圖l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。請回答下列問題：
（1） 將提取的質(zhì)粒與外源DNA分別加入緩沖液中，選用相應(yīng)的限制酶處理時，影響處理效果的外界因素主要是______等（寫出兩點）。
（2） 用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時，能否使用MspⅠ與BamHⅠ同時切割質(zhì)粒與外源DNA？答：______，原因是______
___________________________。
（3） 可選用______（兩種）限制酶同時酶切質(zhì)粒與外源DNA，酶切并連接后可獲得______種含目的基因的重組質(zhì)粒，篩選含有該重組質(zhì)粒的大腸桿菌時，需要在含______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
（4） 為了從基因文庫中分離獲取T2噬菌體抗性基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入對T2噬菌體敏感的大腸桿菌，然后將含有該大腸桿菌的菌液分別接種在預(yù)先涂有______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而初步檢測目的基因的表達。
答案
1. A 2. （1） ABC
（2） 無質(zhì)粒細胞 含X-3的細胞
（3） 4 750
（4） 不能 DNA連接酶對DN段沒有選擇性或者DNA末端相同
3. （1） 溫度、pH
（2） 不能 MspⅠ會切割質(zhì)粒上的兩個標記基因，而BamHⅠ會切割破壞目的基因
基因工程在醫(yī)學(xué)上已得到廣泛應(yīng)用，并且應(yīng)用領(lǐng)域不斷被拓寬，取得了令人驚喜的成就。
1 基因工程制藥
基因工程制藥開創(chuàng)了制藥工業(yè)的新紀元，解決了過去不能生產(chǎn)或者不能經(jīng)濟生產(chǎn)的藥物問題?，F(xiàn)在，人類已經(jīng)可以按照需要，通過基因工程生產(chǎn)出大量廉價優(yōu)質(zhì)的新藥物和診斷試劑，諸如人生長激素、人的胰島素、尿激酶、紅細胞生成素、白細胞介素、干擾素、細胞集落刺激因子、表皮生長因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對性的基因工程蛋白質(zhì)多肽藥物的問世，不僅改變了制藥工業(yè)的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫(yī)治侏儒癥的良藥是人生長激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運用基因工程生產(chǎn)，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們?yōu)榇硕铺祗@的興奮!成本如此之低，又如此之高產(chǎn)，其巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，由此可見。
2 基因工程抗病毒疫苗
為人類抵御病毒侵襲提供了用武之地?；蚬こ桃倚透窝滓呙?、狂犬病疫苗、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應(yīng)用于臨床，提高了人類對各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問世，使我國新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發(fā)病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導(dǎo)彈”，就是按照人類的設(shè)計，把“生物導(dǎo)彈”發(fā)射出去，精確地命中癌細胞，并炸死癌細胞而不傷害健康的細胞。就單克隆細胞而言，單克隆細胞在腫癌的診斷檢測、顯示定位、監(jiān)測病變、監(jiān)測療效等方面也有重要價值。人類還通過基因工程生產(chǎn)抵御各種病菌、血吸蟲、虐原蟲等疫苗，提高人體對各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世，變革了機體的免疫方式。如今，人們翹首關(guān)注困擾人類的艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)疫苗的早日問世?；蚬こ炭贵w技術(shù)的發(fā)展，為克服單克隆抗體生產(chǎn)細胞株在生產(chǎn)過程中的不穩(wěn)定性，為生產(chǎn)大量高效抗病毒疫苗提供了先進的生產(chǎn)工藝。
3 基因工程治療疾病
臨床實踐已經(jīng)表明，基因治病已經(jīng)變革了整個醫(yī)學(xué)的預(yù)防和治療領(lǐng)域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病。現(xiàn)在已知的人類遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運用基因工程技術(shù)或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預(yù)防遺傳疾病的目的。人類精心設(shè)計的基因工程操作，克服了不同個體甚至物種之間由于器官移植所產(chǎn)生的免疫排斥作用，實現(xiàn)人體之間的移植已獲成功，成功的實體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯(lián)合移植。而人體與動物之間的器官移植成為現(xiàn)實，臨床應(yīng)用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學(xué)合成的完善和自動化，脫氧核糖核酸擴增技術(shù)的優(yōu)化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質(zhì)量，是人類所殷切企盼的?；蛑委熡袃煞N途徑，一是體細胞的基因治療，二是生殖細胞的基因治療。體細胞的基因治療是將正常的遺傳基因?qū)胧芫穆鸭毎麅?nèi)，讓這種遺傳物質(zhì)進入受精卵的基因組內(nèi)，并隨著受精卵分裂，分配到每一個子細胞中去，最終糾正未來個體的遺傳缺陷。而生殖細胞的基因治療是將人類設(shè)計的“目的基因”導(dǎo)入患有遺傳病病人的生殖細胞內(nèi)，此法操作技術(shù)異常復(fù)雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無人涉足。
4 基因工程診病
關(guān)鍵詞：植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應(yīng)用;存在問題;展望
葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進入子代細胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。
1葉綠體基因工程概述
1.1葉綠體簡介
葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。
1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點
葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統(tǒng)的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數(shù)[3]。葉綠體基因可實現(xiàn)外源基因的定點整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點,可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時間。
1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程
葉綠體轉(zhuǎn)化過程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。
1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法
依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。
2葉綠體基因工程的應(yīng)用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價值的方法。
2.2合成有機物質(zhì)
由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點,已被越來越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機物質(zhì)的可靠場所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。
2.3生產(chǎn)疫苗
人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實現(xiàn)表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優(yōu)化,分別表達了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報道bt表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受能力。
2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用
葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。
2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景
當(dāng)今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產(chǎn)生超級雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險遠遠低于核轉(zhuǎn)化作物,因為大多數(shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。
3葉綠體基因工程存在的問題
3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題
由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內(nèi)有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。
3.2植物的種類有待擴展
可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。
4展望
雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進展,但對于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點,科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進葉綠體基因工程,使其優(yōu)點更加明顯,必將在未來生物技術(shù)領(lǐng)域帶來又一場革命,為人類造福。
5參考文獻
[1] 劉良式.植物分子遺傳學(xué)[m].北京:科學(xué)出版社,1997.
[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.
[3] 李宏韜,趙淑青,趙彥修,等.葉綠體基因工程簡介[j].遺傳,2003,25(4):495-498.
[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.
[5] 沈桂芳,倪丕沖.植物葉綠
關(guān)鍵詞植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應(yīng)用;存在問題;展望
葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進入子代細胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。
1葉綠體基因工程概述
1.1葉綠體簡介
葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。
1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點
葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統(tǒng)的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數(shù)[3]。葉綠體基因可實現(xiàn)外源基因的定點整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點,可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時間。
1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程
葉綠體轉(zhuǎn)化過程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。
1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法
依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。
2葉綠體基因工程的應(yīng)用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價值的方法。
2.2合成有機物質(zhì)
由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點,已被越來越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機物質(zhì)的可靠場所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。
2.3生產(chǎn)疫苗
人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實現(xiàn)表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優(yōu)化,分別表達了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報道bt表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受能力。
2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用
葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。
2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景
當(dāng)今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產(chǎn)生超級雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險遠遠低于核轉(zhuǎn)化作物,因為大多數(shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。
3葉綠體基因工程存在的問題
3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題
由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內(nèi)有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。
3.2植物的種類有待擴展
可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。
4展望
雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進展,但對于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點,科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進葉綠體基因工程,使其優(yōu)點更加明顯,必將在未來生物技術(shù)領(lǐng)域帶來又一場革命,為人類造福。
5參考文獻
[1] 劉良式.植物分子遺傳學(xué)[m].北京:科學(xué)出版社,1997.
[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.
[3] 李宏韜,趙淑青,趙彥修,等.葉綠體基因工程簡介[j].遺傳,2003,25(4):495-498.
[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.
關(guān)鍵詞：基因工程;實驗室建設(shè);管理
中圖分類號：G647 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）41-0270-02
實驗室是高校開展大學(xué)生和研究生實驗教學(xué)的主要場所，也是高校教師開展科學(xué)研究的重要平臺，是一所大學(xué)教學(xué)、學(xué)科建設(shè)和管理水平的重要體現(xiàn)（袁繼紅等，2011）。通過實驗室開展的實踐教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生動手能力、創(chuàng)新能力以及理論聯(lián)系實際的基本途徑。基因工程是現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中一門極其重要的學(xué)科，我校生命科學(xué)學(xué)院開展的基因工程教學(xué)主要依托農(nóng)業(yè)生物工程研究院的科研平臺進行，對基因工程教學(xué)實驗室進行建設(shè)和管理，期望達到教學(xué)、科研資源共享的目的。為此，以科研平臺建設(shè)的是教學(xué)實驗室有其不同于常規(guī)單一教學(xué)實驗室的管理模式，能使大學(xué)生有更多的機會了解學(xué)科前沿和實際研究狀況，在驗證性實驗的基礎(chǔ)上融進創(chuàng)新性實驗內(nèi)容。經(jīng)過幾年的實踐探索，在提高參與實驗學(xué)生動手能力及培養(yǎng)創(chuàng)新思維發(fā)揮了重要作用，尤其是對進一步攻讀相關(guān)專業(yè)碩士學(xué)位或博士學(xué)位的學(xué)生更具有意義。
一、基因工程實驗室的實驗內(nèi)容與教學(xué)目標
基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)、遺傳工程或DNA重組技術(shù)等，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)。以基因工程操作步驟為主線，含有目的基因分離、克隆，載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選鑒定等實驗內(nèi)容，設(shè)置和選擇實驗內(nèi)容時既要注重專業(yè)性和可操作性，又要突出先進性和系統(tǒng)性。在通過課堂學(xué)習(xí)理論以后，需要通過實驗對基因工程理論有系統(tǒng)、明確的認識，達到熟識、理解并掌握DNA重組的原理和實際操作方法，并在實踐中提高分析問題和解決問題的能力，開拓創(chuàng)新能力，為學(xué)習(xí)相關(guān)專業(yè)課程以及從事生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
我們所建設(shè)的基因工程教學(xué)實驗室進行教學(xué)的目標是培養(yǎng)高年級本科生及研究生進行基因操作的能力。在教學(xué)中，我們以問題導(dǎo)向，充分調(diào)動教、學(xué)雙方的主觀能動性，積極組織學(xué)生參與實驗的準備工作;在實驗中，安排學(xué)生與教師共同討論實驗涉及的理論問題和實驗內(nèi)容可能應(yīng)用的問題，指導(dǎo)學(xué)生分析總結(jié)實驗結(jié)果和存在的問題。以培養(yǎng)學(xué)生興趣為主，發(fā)展一批從事基因工程研究的后備力量，據(jù)不完全統(tǒng)計，繼續(xù)深造讀研的學(xué)生占總?cè)藬?shù)的30%以上。
二、構(gòu)建實驗體系，全面提高學(xué)生實驗技能
基因工程實驗內(nèi)容主要包括基因獲得、載體構(gòu)建、基因?qū)?、基因表達4個方面，但在進行實驗教學(xué)時，往往不是完全直接以此4個方面開展實驗。通過幾年的本科基因工程實驗教學(xué)經(jīng)驗，逐漸形成了以基因工程經(jīng)典性、基礎(chǔ)性實驗為主，強調(diào)實驗的連續(xù)性，并結(jié)合植物基因工程實驗室研究設(shè)計實驗。我們的做法是：
1.基因的獲得，主要采用從克隆載體上酶切獲得目標基因、通過PCR擴增目的基因、人工合成DNA序列。在基因分離、克隆這部分知識的實驗室驗證教學(xué)中，往往是安排“基因組DNA分離提取技術(shù)”、“RNA分離提取技術(shù)及cDNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)”、“基因酶切與DNA的瓊脂糖電泳技術(shù)”、“PCR技術(shù)”、“電泳膠回收DNA技術(shù)”。
2.載體構(gòu)建。這部分實驗內(nèi)容和基因獲得部分是難以分開的，常常是將酶切后電泳回收的目標基因、RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、人工化學(xué)合成的基因序列、PCR擴增的DNA序列構(gòu)建在亞克隆載體上、或構(gòu)建目標基因在表達載體上。這部分實驗室教學(xué)內(nèi)容主要有“載體構(gòu)建技術(shù)”、“基因連接技術(shù)”等。
3.目的基因?qū)?。根?jù)受體細胞不同導(dǎo)入方法也不同，包括感受態(tài)細胞的制備、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，基因槍法（或微彈轟擊法），花粉管通道法以及顯微注射技術(shù)等，結(jié)合本實驗室研究內(nèi)容，以植物細胞為主，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，以模式植物煙草為受體材料，通過組織培養(yǎng)再生實驗獲得轉(zhuǎn)目的基因煙草植株。
4.目的基因在宿主基因組上的整合、表達、檢測及轉(zhuǎn)基因生物的篩選，實驗內(nèi)容包括報告基因的組織化學(xué)染色、PCR擴增目的基因、southern blot、Northern blot、Western Blot等實驗內(nèi)容涵蓋了基因工程的主要操作過程和內(nèi)容，可使學(xué)術(shù)全面掌握基因工程技術(shù)。
結(jié)合本實驗室特點，設(shè)置4個實驗內(nèi)容，包括DN段得連接、轉(zhuǎn)化及酶切鑒定，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化植物的表型分析及鑒定，轉(zhuǎn)基因植物的性狀分析及基因表達產(chǎn)物提取和檢測。從2006年開始，已經(jīng)培養(yǎng)生物技術(shù)及生物科學(xué)專業(yè)的本科生600余人。
三、加強“物、教師、學(xué)生”管理，全面提高實驗教學(xué)效率
儀器設(shè)備是基因工程實驗得以開設(shè)的基礎(chǔ)，本實驗室儀器設(shè)備總值達到2394余萬元，完全具備開展基因工程實驗所需硬件條件。在實驗過程中需要使用大量儀器，包括PCR儀、離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋等，種類繁多，價格昂貴，學(xué)生很容易因為不當(dāng)操作導(dǎo)致儀器損壞，導(dǎo)致維修經(jīng)費開支巨大，因此“物”的管理顯得尤為重要，必須嚴格建立實驗儀器臺賬，利用儀器管理軟件對儀器出入庫、維修及報廢等做好記錄，便于對每臺儀器隨時跟蹤管理。嚴格按照“賬、物、卡”管理，每臺儀器責(zé)任到人，做好使用登記，定期組織老師對儀器進行排查和維護，保證學(xué)生實驗的順利開展。
教師和實驗技術(shù)人員是實驗教學(xué)的實施者，在注重培養(yǎng)學(xué)生獨立開展實驗的能力的同時，教學(xué)中要引導(dǎo)學(xué)生注意理論知識與實驗內(nèi)容的結(jié)合，要講解清楚實驗內(nèi)容的基本原理、操作的關(guān)鍵步驟，甚至要指出可能的誤操作引起的問題。因此教師和實驗技術(shù)人員業(yè)務(wù)水平非常重要，目前本實驗室已有從事基因工程教學(xué)工作教師10人，均獲得博士學(xué)位，專職實驗技術(shù)人員9人（含博士1人，在讀博士3人）。
學(xué)生作為實驗教學(xué)的主體，在實驗設(shè)置時應(yīng)充分考慮學(xué)生的水平和接受程度，要鼓勵學(xué)生按照操作步驟進行實驗操作，也要要求學(xué)生清楚每一步操作步驟的理論原理以及所使用儀器的基本性能和操作標準規(guī)程，才能完成好實驗內(nèi)容的學(xué)習(xí)，對于出現(xiàn)的問題能夠有自己的見解。只有做到“物、教師、學(xué)生”三者的有機結(jié)合，才能提高基因工程實驗教學(xué)質(zhì)量。
四、展望
基因工程是一門新興的學(xué)科，由于基因概念較為抽象，單憑課堂講解很難完全掌握該門課程的理論基礎(chǔ)和操作技術(shù)，需要開展相應(yīng)實驗教學(xué)，印證課堂教學(xué)內(nèi)容，通過課堂教學(xué)-實驗教學(xué)-知識回顧，才能真正理解基因工程技術(shù)的精要內(nèi)容。
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Discussion for the Construction and Administration of Genetic Engineering Laboratory in University
ZHAO Dan1，ZHAO De-gang1
（“The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education），Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou Province 550025”）
一、高中生物課程資源開發(fā)案例
教材是最重要的課程資源，它在課程資源的開發(fā)與利用中往往起到主導(dǎo)和疏導(dǎo)作用。因此嘗試以學(xué)科知識為背景，不斷分析課標和教材，明確教材中哪些內(nèi)容與本市生物產(chǎn)業(yè)相聯(lián)系。另外一個生物產(chǎn)業(yè)所應(yīng)用的生物學(xué)原理是多層次多方位緊密相聯(lián)的，因此又將高中生物必修和選修課本，打亂模塊順序，以本市生物產(chǎn)業(yè)資源為線索，將與高中生物課本相關(guān)的知識點串聯(lián)起來，進行了高中生物本地生物產(chǎn)業(yè)課程資源和教材資源的整合。嘗試通過參觀調(diào)查，使學(xué)生加深對所學(xué)生物學(xué)原理和技術(shù)的理解，增強學(xué)生的應(yīng)用能力及知識的遷移能力。通過體驗企業(yè)文化，了解相關(guān)的職業(yè)和就業(yè)素質(zhì)，增強學(xué)生職業(yè)意識和社會責(zé)任感。現(xiàn)舉兩例簡要說明。
1.“發(fā)酵工程”課程資源——深圳金威啤酒釀造有限公司
對于微生物相關(guān)知識，看不見摸不著，內(nèi)容細微而深奧，條件好的學(xué)?？梢栽陲@微鏡下看看酵母，條件不好的學(xué)校學(xué)生根本不知酵母長什么樣，對于微生物培養(yǎng)，發(fā)酵等知識，限于條件，高中學(xué)校也很難開設(shè)。學(xué)生通常只是通過書本的文字和圖片，通過老師歸納出流程圖，進行理解和記憶。學(xué)生學(xué)起來難于理解且很難將這些知識上升到一個感性認識。深圳金威啤酒釀造有限公司擁有目前國內(nèi)最先進的啤酒生產(chǎn)技術(shù)和設(shè)備，其“不添加甲醛釀造”的綠色啤酒工藝帶動了行業(yè)的科技創(chuàng)新與技術(shù)進步，被科技部列為國家科技成果重點推廣項目。公司的污水處理站是市工業(yè)污水治理的樣板工程。并且該公司是“深圳市工業(yè)旅游景點”之一，這為我們中學(xué)生學(xué)習(xí)微生物應(yīng)用相關(guān)知識提供了良好的條件。
例如學(xué)生在參觀調(diào)查時可以通過現(xiàn)場體驗生產(chǎn)工藝的過程，了解微生物的類群，分離、純化、培養(yǎng)、計數(shù)及保存方法；了解培養(yǎng)基的配制原則及種類，體驗消毒和滅菌方法，聯(lián)系種群生長曲線，思考為什么酵母發(fā)酵時要補充加料；聯(lián)系無氧呼吸及有氧呼吸，影響種群密度的生態(tài)因子，思考影響微生物生長的環(huán)境因素，酵母發(fā)酵時需要控制的因素，體驗質(zhì)檢人員如何對其質(zhì)量進行控制；參觀污水處理站時，體驗其污水處理工藝，理解生物的凈化作用，水體的富營養(yǎng)化及生態(tài)工程所遵循的協(xié)調(diào)與平衡原理等。并且可以激發(fā)學(xué)生討論微生物在實際生活生產(chǎn)中的應(yīng)用。這樣不僅使學(xué)生在實踐的過程中，自覺地把間接的理論知識與直接的感受和體驗結(jié)合起來，加強了學(xué)生與生活、與社會的聯(lián)系而且進一步拓展了學(xué)生的思維。
2.“基因工程”課程資源——深圳華生元基因工程有限公司
深圳華生元基因工程有限公司是國內(nèi)最早研究基因工程并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的公司，成功生產(chǎn)國內(nèi)第一例基因工程藥物——重組人表皮生長因子(rEGF)。
基因工程相關(guān)知識涉及必修和選修兩個模塊，內(nèi)容抽象深奧，雖然課本圖文并茂，并且用了形象生動的比喻來說明基因工程的基本工具，如將限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、質(zhì)粒類比成基因的“剪刀”“針線”“運載體”。但是只憑教師講述是很枯燥抽象，學(xué)生也難以理解。而去到深圳華生元基因工程有限公司實地參觀之后，對于這種分子水平的操作就有會有一個具體形象的感性認識，原來和自己所想的有太大的差別。在參觀的過程中，學(xué)生不但對于基因是什么，在哪里，有什么功能，原核細胞和真核細胞的基因結(jié)構(gòu)的區(qū)別，基因?qū)ι镄誀畹目刂?，基因表達的中心法則，獲得目的基因的方法，DNA的復(fù)制，基因工程原理這些基礎(chǔ)知識會有一個更深的理解。而且也可直觀的感受PCR體外擴增技術(shù)，基因工程操作步驟，基因工程操作的工具，檢測基因的表達時的方法。同時也會激發(fā)學(xué)生調(diào)查基因工程產(chǎn)品在社會中的應(yīng)用情況、討論轉(zhuǎn)基因生物利與弊的興趣，開拓了思維。
二、本地生物課程資源開發(fā)整合利用的體會
深圳市生物產(chǎn)業(yè)資源非常豐富，與高中生物相聯(lián)系的本市生物產(chǎn)業(yè)課程資源還有許多，還需要教師不斷地開發(fā)，通過實踐上的應(yīng)用實例，讓學(xué)生身臨其境，親身體驗，比單純的應(yīng)用間接的載體給學(xué)生呈現(xiàn)相關(guān)知識，更能使學(xué)生更好的理解了生物學(xué)原理，增強了學(xué)生的應(yīng)用能力、理解力及知識的遷移能力，拓寬了學(xué)生的知識面，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注身邊的生物現(xiàn)象，增加了學(xué)生學(xué)習(xí)生物的興趣。
在參觀調(diào)查中，不僅可以讓學(xué)生的生物學(xué)知識有一個更深的理解，而且也可以讓學(xué)生從中學(xué)習(xí)一些社會學(xué)經(jīng)濟學(xué)相關(guān)的知識。比如可以讓學(xué)生了解該公司的企業(yè)文化是什么?調(diào)查該公司年產(chǎn)值是多少?經(jīng)濟效益如何?為社會提供了多少個就業(yè)崗位?有哪些職業(yè)崗位，就業(yè)條件是什么?該公司提出了哪些技術(shù)革新目標?在與生物技術(shù)從業(yè)人員的面對面的交流過程中，無形中指導(dǎo)學(xué)生的就業(yè)觀，幫助學(xué)生了解相關(guān)的職業(yè)和學(xué)習(xí)方向，增強學(xué)生的社會責(zé)任感，為進一步學(xué)習(xí)和步入社會做準備。同時這也是新課程標準對高中生物教師提出的一個新要求。
一、種類
根據(jù)抗原性質(zhì)可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗；根據(jù)疫苗功效則可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。
1. 滅活疫苗。將分類離培養(yǎng)的病原微生物（多數(shù)為強毒株）用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑將其滅活但保留其免疫原性，與不同的佐劑混合后乳化制成滅活疫苗。目前，用于制備滅活疫苗的佐劑有礦物油佐劑和氫氧化鋁佐劑。前者多用于病毒性疫苗，如當(dāng)前使用的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、偽狂犬病毒滅活疫苗；用氫氧化鋁作為佐劑制備疫苗靜置后，會出現(xiàn)分層，疫苗在使用前搖勻即可，該佐劑多用于細菌疫苗。蜂膠佐劑多用于細菌苗和亞單位疫苗。
滅活疫苗的用途：①新分離的病原，短期內(nèi)難以致弱。如高致病性豬藍耳病滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗和兔瘟滅活疫苗。②血清型較多的病原，疫苗的保護力呈現(xiàn)血清型特異性，如豬胸膜肺炎放線桿菌（15 個血清型）、副豬嗜血桿菌（15 個血清型）、豬鏈球菌（35 個血清型）等。③變異頻率高的病原，如新分離的口蹄疫Mya-98 株。
豬用滅活疫苗中，有豬偽狂犬病滅活疫苗、豬口蹄疫0 型（單價/ 二價/ 三價）滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、豬細小病毒滅活疫苗、豬乙腦滅活疫苗、豬鏈球菌病單價( 二價/ 三價) 滅活疫苗、副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗和豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗等。
滅活疫苗的優(yōu)點是安全性強，疫苗毒株無毒力返強的危險；多數(shù)疫苗的免疫接種效果不受仔豬母源抗體水平高低的干擾；貯存條件方面，一般需冷藏保存，不能冷凍。其缺點是需要免疫次數(shù)多，接種后局部反應(yīng)略大，甚至出現(xiàn)接種部位污染，可引起局部炎癥膿腫，影響接種效果，也降低局部的肉品質(zhì)量。
2．弱毒活疫苗。
疫苗種類指將毒力下降或毒力完全喪失的病原微生物，與牛奶、明膠等佐劑混合后經(jīng)過低溫凍干后形成的疏松狀制劑。嚴格意義上，此類疫苗不包含采用基因工程方法對基因組改變后引起致病性改變的微生物制備的弱毒疫苗。根據(jù)所含的疫苗毒株分類不同，可以分為以下幾種：（1）細菌活疫苗：如仔豬副傷寒疫苗，豬丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。（3）豬支原體肺炎活疫苗。預(yù)防豬寄生蟲的活疫苗尚未問世。
我國常用的弱毒活疫苗較多，如豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬乙肝疫苗、豬丹毒活疫苗、豬肺疫活疫苗、仔豬副傷寒疫苗、豬馬腺疫鏈球菌活疫苗等。
活疫苗的優(yōu)點與缺點：優(yōu)點是：（1）免疫途徑多樣：可通過肌肉注射、滴鼻、口服等途徑免疫。（2）刺激產(chǎn)生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途徑免疫后可刺激機體產(chǎn)生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在預(yù)防呼吸道感染和消化道感染中具有獨特的作用，這是滅活疫苗無法比擬的，如沙門氏菌口服可以刺激機體腸道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，免疫效果較為確實。（4）免疫次數(shù)少于滅活疫苗。（5）接種后局部反應(yīng)低。缺點：受母源抗體的影響如豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗等；受抗菌藥物的影響如仔豬副傷寒弱毒疫苗、豬丹毒- 肺疫二聯(lián)弱毒疫苗和豬支原體弱毒疫苗等；活疫苗運輸保存條件嚴格，需冷凍條件。
3. 基因工程疫苗。
利用分子生物學(xué)手段改造病原微生物的基因，獲得毒力下降、喪失的突變株或構(gòu)建以弱毒株為載體、表達外源基因的重組毒（菌）株，并利用它們作為疫苗毒株制備疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活載體疫苗。該疫苗與常規(guī)弱毒疫苗相比，主要區(qū)別在于后者采用常規(guī)技術(shù)，而非分子生物學(xué)技術(shù)，來致弱病原微生物，不確定其毒力致弱的分子機制。
作為基因工程疫苗載體的病毒或細菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、對靶動物和非靶動物是安全的，基因組龐大、可容納外源基因，并高效表達。常用的活載體有：偽狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙門氏菌弱毒菌株、乳酸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌弱毒株。我國在“十一五”期間，在“863”課題資助下，開展了以偽狂犬病毒為載體，表達豬細小病毒、乙腦病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因的研究。鑒于對其安全性的憂慮，我國規(guī)定轉(zhuǎn)基因生物（包含基因工程 疫苗）必須經(jīng)歷實驗室和野外安全性觀察測試，獲得安全證書后，方能進行疫苗學(xué)研宄，以申報獸用生物制品新獸藥證書。目前，我國己經(jīng)批準上市的基因工程疫苗有：豬偽狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、豬大腸桿菌K88-K99 基因工程疫苗。重組載體疫苗尚未正式上市。
4．核酸疫苗。
核酸疫苗產(chǎn)生于20 世紀80 年代。將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達載體中制備重組質(zhì)粒，這種質(zhì)粒直接導(dǎo)入動物體內(nèi)，利用宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，合成該蛋白，剌激機體產(chǎn)生針對相應(yīng)的細胞免疫和體液抗體，因而稱之為DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大腸桿菌大量制備，成本較低。針對細菌病、病毒病和寄生蟲病的DNA 疫苗報道較多。但基于是否整合到宿主染色體等安全性考慮，核酸疫苗多處于實驗研宄階段，尚未大量應(yīng)用。RNA 疫苗是近幾年才出現(xiàn)的一種核酸疫苗，主要在人類醫(yī)學(xué)中，作為RNA 類藥物，用于抗腫瘤研宄。在動物疫苗領(lǐng)域尚未見RNA 疫苗的應(yīng)用報道。
5. 亞單位疫苗與合成肽疫苗。
利用物理化學(xué)方法提純病原微生物中具免疫原性的組份，或者利用基因工程表達該組分，純化后加入佐劑而制成。豬傳染性胸膜肺炎的亞單位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供對所有15 個血清型的交叉保護力。我國使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有較強免疫原性的抗原片段，加入佐劑制成。該疫苗的優(yōu)點是抗原組分單一，純度高，免疫反應(yīng)強，副作用低；能迅速針對新出現(xiàn)變異毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本較高。
6．轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗。
將病原微生物中編碼免疫蛋白的基因插入植物基因組中，獲得表達病原微生物免疫原性的植物，再從植物中提純蛋白用于注射動物或?qū)⒅参镏苯语曃箘游?，產(chǎn)生免疫力。用于表達免疫原性基因的植物主要是馬鈴薯、玉米、蔬菜、番茄、煙草和香蕉等，稱為轉(zhuǎn)基因可飼疫苗（ediable vaccine)。此類疫苗在口蹄疫（擬南芥、苜蓿和馬鈴薯為受體)、豬傳染性胃腸炎（馬鈴薯、花椰菜和土豆為受體)、腹瀉（煙草為受體）和輪狀病毒感染（番茄和馬鈴薯為受體）等疾病防控中有研究的報道,但未見臨床應(yīng)用。目前的技術(shù)難題是：選擇直接生食和貯藏方便的植物作為表達植株（煙草不適用于動物基因的篩選和優(yōu)化其密碼子和使用合適啟動子，使其表達量滿足疫苗免疫劑量的要求；免疫劑量免疫程序的確定；并設(shè)法提高口服后黏膜免疫效果。轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗主要應(yīng)用在胃腸道疾病中。
二、疫苗使用的注意事項
1． 建立在正確的流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，有針對性選擇所需疫苗，不可盲從。對于多血清型菌株感染，應(yīng)選擇與當(dāng)?shù)亓餍芯暄逍鸵恢碌囊呙纾庖咝Ч_實。
2．確保疫苗運輸和使用過程中的冷鏈保障。如疫苗的物理性狀己經(jīng)改變，如分層現(xiàn)象，不可用手工混勻后再使用，應(yīng)丟棄。
3．細菌活疫苗使用前后不可同時使用抗生素或有抗菌活性的中草藥。
4．建議使用于健康豬群；正在發(fā)病豬群使用緊急接種，可能會加快處于疾病晚期豬只死亡，但是會縮短豬群的病程，因此要有心理準備。
5．制定合理的免疫程序，避免母源抗體干擾。不同疫苗接種之間至少間隔1 周。不同疫苗的同時混合使用，要先做小范圍的觀察，如無副反應(yīng)，再大群使用。
