時間：2023-12-20 11:36:34
緒論：在尋找寫作靈感嗎？愛發(fā)表網(wǎng)為您精選了8篇生物細(xì)胞的功能，愿這些內(nèi)容能夠啟迪您的思維，激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，歡迎您的閱讀與分享！
一、知識結(jié)構(gòu)二、教學(xué)目的
1.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)含有的物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的主要功能(C：理解)。
2.線粒體和葉綠體的基本結(jié)構(gòu)及主要功能(C：理解)。
3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體、中心體、液泡這幾種細(xì)胞器的主要功能(C：理解)。
三、重點和難點
1.教學(xué)重點
(1)線粒體和葉綠體的基本結(jié)構(gòu)及主要功能。
(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體、中心體、液泡的主要功能。
2.教學(xué)難點
線粒體和葉綠體的基本結(jié)構(gòu)和主要功能。
四、教學(xué)建議
本小節(jié)的教學(xué)內(nèi)容，應(yīng)結(jié)合學(xué)生實驗統(tǒng)籌考慮。例如，細(xì)胞質(zhì)的概念、組成部分(基質(zhì)、細(xì)胞器)的關(guān)系、葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能等內(nèi)容，可以在有關(guān)的學(xué)生實驗中學(xué)習(xí)。
關(guān)于細(xì)胞質(zhì)的教學(xué)，重點是講述各種細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)特點和主要功能。根據(jù)學(xué)生的接受能力，可對結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的特點，各種結(jié)構(gòu)功能之間的聯(lián)系，進(jìn)行不同程度的分析。
在講述線粒體時，要充分利用教材中的示意圖，讓學(xué)生注意觀察線粒體的結(jié)構(gòu)特點和它浸浴在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的狀況。在分析線粒體外膜時，一方面要指出外膜使線粒體相對獨立于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)；另一方面又要指出，通過外膜使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與線粒體內(nèi)部進(jìn)行著物質(zhì)交換。在分析線粒體內(nèi)膜時，要注意使學(xué)生理解內(nèi)膜的折疊增加了內(nèi)膜的表面積，這有利于有氧呼吸酶系的附著，有利于有氧呼吸的化學(xué)反應(yīng)大量地進(jìn)行。
講述葉綠體時，要在對葉綠體成分和結(jié)構(gòu)特點的分析中，滲透出它與高效利用光能(如基粒中垛疊的囊狀結(jié)構(gòu))，完成光合作用一系列反應(yīng)(如含光合作用的色素、酶)是相適應(yīng)的。在教學(xué)中，可適當(dāng)對比線粒體和葉綠體。
關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的教學(xué)，要盡可能利用立體結(jié)構(gòu)示意圖，使學(xué)生正確理解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)特點和在細(xì)胞質(zhì)中的狀況。關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用，一方面擴(kuò)大了細(xì)胞內(nèi)的膜表面積，形成了物質(zhì)運輸通道；另一方面與脂質(zhì)、糖類和蛋白質(zhì)的合成有密切關(guān)系。
在講述核糖體時，要注意引導(dǎo)學(xué)生觀察插圖，知道有的核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的外側(cè)，有的游離在細(xì)胞質(zhì)的基質(zhì)中，因此，核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是相對獨立的兩種細(xì)胞器。要指出核糖體無膜結(jié)構(gòu)，它是合成蛋白質(zhì)的場所(如果時間允許，還可以回顧氨基酸縮合成肽的知識)。如果學(xué)生條件較好，教學(xué)中可適當(dāng)滲透出附著的和游離的這兩類核糖體所合成的蛋白質(zhì)的去向有所不同。附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，繼續(xù)進(jìn)行加工并被運輸。
關(guān)于高爾基體的教學(xué)，要結(jié)合細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖，說明它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜的相互聯(lián)系，理解高爾基體對細(xì)胞分泌物的形成、加工和轉(zhuǎn)運的作用。在植物細(xì)胞中，它合成的纖維素對細(xì)胞壁的形成有重要作用。
對于中心體和液泡的教學(xué)，不必擴(kuò)展，有些作用可結(jié)合后面有關(guān)知識進(jìn)行講述。
本小節(jié)教學(xué)的總結(jié)，可以用動物或植物細(xì)胞的整體示意圖，分析各種細(xì)胞器之間的結(jié)構(gòu)聯(lián)系和功能聯(lián)系。
五、參考答案
復(fù)習(xí)題一、1.線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，染色質(zhì)，高爾基體，中心粒。2.〔4〕高爾基體。3.〔2〕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。4.〔5〕中心體。5.〔1〕線粒體。
二、1.(C)；2.(B)；3.(C)；4.(B)；5.(A)；6.(B)。
三、在葉綠體的3、4部分。
實驗討論題1.葉綠體在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中不是靜止不動的。呈橢球體形的葉綠體在不同的光照條件下可以運動，這種運動能夠隨時改變橢球體的方向，使葉綠體既能接受較多的光照，又不至于被強(qiáng)光灼傷。
2.葉綠體的形態(tài)和分布都有利于接受光照，完成光合作用。如葉綠體呈橢球形，它能夠在不同光照條件下改變方向。又如，葉肉細(xì)胞中的柵欄組織，其中的葉綠體分布比海綿組織的多，這可以接受更多的光照。
3.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中含有多種無機(jī)化合物和有機(jī)化合物，還有很多種酶。細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是活細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝的主要場所。植物細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)的流動，有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運輸和細(xì)胞器的移動，從而為細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝提供所需要的物質(zhì)和有關(guān)條件。
六、參考資料
細(xì)胞質(zhì)的概念廣義地說，就真核生物而言，在細(xì)胞膜以內(nèi)，除了細(xì)胞核以外的其他部分，都屬于細(xì)胞質(zhì)。但是狹義地說，細(xì)胞質(zhì)是指細(xì)胞質(zhì)的可溶相，即指除了細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器和內(nèi)含物以外的基質(zhì)部分。這部分在光學(xué)顯微鏡下，看不出有任何定形的結(jié)構(gòu)，是均勻透明的，所以稱為透明質(zhì)，也稱為細(xì)胞液、細(xì)胞基質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)?？墒?，細(xì)胞有許多復(fù)雜的運動現(xiàn)象，又啟發(fā)細(xì)胞學(xué)研究者考慮到細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能不會這樣簡單。電子顯微鏡的使用，使我們對于細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有越來越深入的了解。在20世紀(jì)60年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是一種呈連續(xù)相的物質(zhì)。
真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，包含著相同的組成成分：核糖體、RNA分子、球蛋白、酶等。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的含量占細(xì)胞的蛋白質(zhì)總量的20%～25%。在細(xì)胞質(zhì)中最重要的可溶性酶，是與糖酵解及與蛋白質(zhì)合成中氨基酸有關(guān)的一些酶。此外，許多需要ATP參與反應(yīng)的酶及可溶性轉(zhuǎn)移酶，也存在于細(xì)胞質(zhì)中。
緊貼在細(xì)胞膜下面的細(xì)胞質(zhì)，被認(rèn)為是一種高度異質(zhì)的膠體系統(tǒng)。細(xì)胞學(xué)家早就發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)有彈性和黏滯性，也看到布朗運動和細(xì)胞質(zhì)川流運動。這就證明細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是始終如一，而是隨著溫度、日光、壓力等環(huán)境條件而改變的。近些年來，利用電鏡技術(shù)，尤其是高壓電鏡技術(shù)和生化、免疫技術(shù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的確不是均一的，其中含有光學(xué)顯微鏡下看不到的超微結(jié)構(gòu)。目前，細(xì)胞生物學(xué)家已經(jīng)闡明：細(xì)胞質(zhì)是一個錯綜復(fù)雜的、相互聯(lián)系的、高度有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這些細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可用“細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)”這個專有名詞表達(dá)。也就是說，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)這個名詞，除包括組成細(xì)胞骨架的三種主要纖絲──微絲、微管和中間纖維，以及一個由纖絲橋所組成的相互交聯(lián)的絲狀結(jié)構(gòu)──微梁系統(tǒng)(或微梁網(wǎng)格)外，還包括和它們有聯(lián)系的蛋白質(zhì)和水分。
細(xì)胞質(zhì)的功能細(xì)胞質(zhì)具有多方面的功能。但是，由于它本身太脆弱，以致生理學(xué)家至今不能用很好的方法來驗證它的真正的生理功能。不過，毫無疑問，細(xì)胞質(zhì)對細(xì)胞生命活動有著極其重要的作用。從生物學(xué)的角度和細(xì)胞質(zhì)中的各種物質(zhì)來看，它具有以下幾方面的功能。
1.管制外來物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或排出細(xì)胞外的作用，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的“水化”作用。
2.對于如鞭毛和纖毛等后成質(zhì)的形成，以及對于細(xì)胞內(nèi)含物的儲藏具有重大作用。例如，蛋白質(zhì)、脂肪粒、肝糖元、植物堿等多數(shù)集存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
3.為維持細(xì)胞器實體的完整性，提供所需要的離子環(huán)境。
4.供給細(xì)胞器行使功能所必須的一切底物。，全國公務(wù)員共同天地
5.影響細(xì)胞的分化。例如在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞質(zhì)對于分化起著很重要的作用。這已經(jīng)為實驗胚胎學(xué)的大量事實所證實。
6.進(jìn)行某些生化活動，如上面提到的糖酵解、核酸、脂肪酸和氨基酸代謝的某個階段，需要依靠細(xì)胞質(zhì)中處于相對游離狀態(tài)的酶來完成。
細(xì)胞質(zhì)流動在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)以各種不同的方式在流動著，包括細(xì)胞質(zhì)環(huán)流、穿梭流動和布朗運動等，這些也同微絲和微梁系統(tǒng)的存在有密切的關(guān)系。
1.細(xì)胞質(zhì)環(huán)流。是細(xì)胞質(zhì)流動的一種形式。在液泡發(fā)達(dá)的植物(如黑藻、輪藻、伊樂藻)細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)成薄層沿著細(xì)胞膜以一定的速度和方向循環(huán)流動。這種不斷地循環(huán)流動稱為細(xì)胞質(zhì)環(huán)流。環(huán)流的速度，伊樂藻是10μm／s，輪藻是50μm／s。普通植物細(xì)胞則是每秒幾微米至幾十微米。
2穿梭流動。穿梭流動是細(xì)胞質(zhì)流動的另一種形式，它與環(huán)流不同，是向相反方向來回穿梭。由于流動方向在一定時間內(nèi)來回交換，因此叫穿梭流動。絨泡菌是研究這種流動的最好材料。它是一種黏菌，是多核的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)，沒有細(xì)胞的分隔。黏菌的外緣是凝膠樣的外質(zhì)，核心是溶膠樣的內(nèi)質(zhì)。在內(nèi)外質(zhì)中含有許多葉脈狀的微細(xì)分支，在中央集攏在一起成為主脈，細(xì)胞質(zhì)就從支脈向主脈流動(圖2-5，1、2)。內(nèi)質(zhì)的流動速度很快，為1.3mm／s，比細(xì)胞質(zhì)環(huán)流快得多。這樣，絨泡菌一頭的體積縮小，另一頭的體積增大，長出偽足狀的突起，就暫時停止流動(圖2-5，3)，隨后就又開始逆向流動(圖2-5，4、5)，來回穿梭進(jìn)行。
3.布朗運動。在活細(xì)胞中可以看到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的許多小顆粒在無規(guī)則地跳動著，這在暗視野顯微鏡下觀察更為明顯，叫做布朗運動。布朗運動的產(chǎn)生除了與微絲的存在有關(guān)外，還與微梁網(wǎng)格的收縮有關(guān)。
圖2-5絨泡菌中細(xì)胞質(zhì)的穿梭流動
1.2.細(xì)胞質(zhì)從左向右流動3.右側(cè)形成偽足突起，流動暫停
4.5.細(xì)胞質(zhì)又向相反方向從右向左流動。箭頭長度表示流動速度。
線粒體細(xì)胞的有氧呼吸主要是在線粒體內(nèi)進(jìn)行的。線粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下不能分辨，只有在電子顯微鏡下才能看清楚。線粒體由內(nèi)外兩層膜組成。外膜即界限膜，使線粒體與周圍的細(xì)胞質(zhì)分開，是各種分子和離子進(jìn)入線粒體內(nèi)部的障壁。內(nèi)膜的不同部位向線粒體的中心腔折疊，形成嵴。這樣就大大增加了酶分子附著的表面，并且把酶分子密集地包在線粒體里。內(nèi)膜和外膜在化學(xué)成分和物理特性上都有顯著的差異。例如，它們在蛋白質(zhì)的含量，特別是在類脂的分布上是很不相同的。外膜比內(nèi)膜的磷脂含量要高2～3倍；外膜的通透性也比內(nèi)膜高得多。外膜的通透性高，為線粒體與周圍細(xì)胞質(zhì)之間進(jìn)行充分的物質(zhì)交換提供了條件。內(nèi)膜的通透性差，可以使催化三羧酸循環(huán)的復(fù)雜酶系統(tǒng)保留在內(nèi)膜的間隔中，從而保證細(xì)胞有氧呼吸的進(jìn)行。線粒體膜上還具有小孔，這樣，有氧呼吸所產(chǎn)生的ATP可以更容易地向線粒體外面擴(kuò)散。
線粒體既然是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，那么，有關(guān)催化三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞、能量轉(zhuǎn)換、DNA復(fù)制和RNA合成等過程所需要的100多種酶和輔酶，都分布在線粒體的外膜上、膜內(nèi)空間及內(nèi)膜和基質(zhì)中。這些酶和輔酶的主要功能是參加三羧酸循環(huán)中的氧化反應(yīng)、電子傳遞和能量轉(zhuǎn)換。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又叫做顆粒型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，常見于蛋白質(zhì)合成旺盛的細(xì)胞中。粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大多為扁平的囊，少數(shù)為球形或管泡狀的囊。在靠近核的部分，囊泡可以與核的外膜連接。粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面所附著的核糖體(也叫核糖白體)是合成蛋白質(zhì)的場所，新合成的蛋白質(zhì)就進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊腔內(nèi)。粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)既是新合成的蛋白質(zhì)的運輸通道，又是核糖體附著的支架。
滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又稱為非顆粒型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊壁表面光滑，沒有核糖體附著?；嫘蛢?nèi)質(zhì)網(wǎng)的形狀基本上都是分支小管及小囊，有時小管排列得非常緊密，以同心圓形式圍繞在分泌顆粒和線粒體的周圍。因此，滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在切面中所看到的形態(tài)，與粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有明顯的不同。
滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與蛋白質(zhì)的合成無關(guān)，可是它的功能卻更為復(fù)雜，它可能參與糖元和脂質(zhì)的合成、固醇類激素的合成以及具有分泌等功能。在胃組織的某些細(xì)胞的滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上曾發(fā)現(xiàn)有Cl-的積累，這說明它與HCl的分泌有關(guān)。在小腸上皮細(xì)胞中，可以觀察到它與運輸脂肪有關(guān)。在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可能與傳導(dǎo)興奮的作用有關(guān)；在平滑肌細(xì)胞內(nèi)，卻發(fā)現(xiàn)它與Ca2+的攝取和釋放有關(guān)。
核糖體核糖體是由核糖體的核糖核酸(符號為rRNA)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的橢圓形的粒狀小體，其中rRNA和蛋白質(zhì)的比例為1∶1。蛋白質(zhì)分子基本上排列于核糖體的表面上，rRNA分子被包圍于中央。細(xì)胞內(nèi)有的核糖體附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外面，稱為固著核糖體，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成上面所談到的粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；有的不附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，稱為游離核糖體，常見于未分化的細(xì)胞中。附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，附著的情況也不相同。在某些細(xì)胞中，核糖體均勻地附著于細(xì)胞質(zhì)中某一部分的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；有的卻集中地附著于細(xì)胞質(zhì)中某一部分的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
核糖體是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場所?，F(xiàn)在已知，附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體所合成的蛋白質(zhì)，與游離于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的核糖體所合成的蛋白質(zhì)有所不同。附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，主要是合成某些專供輸送到細(xì)胞外面的分泌物質(zhì)，如抗體、酶原或蛋白質(zhì)類的激素等；游離核糖體所合成的蛋白質(zhì)，多半是分布在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中或供細(xì)胞本身生長所需要的蛋白質(zhì)分子(包括酶分子)，此外還合成某些特殊蛋白質(zhì)，如紅細(xì)胞中的血紅蛋白等。因此，在分裂活動旺盛的細(xì)胞中，游離核糖體的數(shù)目就比較多，而且分布比較均勻。這一點已被用來作為辨認(rèn)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。
不管是附著的核糖體還是游離的核糖體，在進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的過程中，常常是幾個核糖體聚集在一起進(jìn)行活動，這是由于信息核糖核酸(mRNA)把它們連串在一起。這樣的一個功能單位的聚合體稱為多聚核糖體。
高爾基體高爾基于細(xì)胞核附近的細(xì)胞質(zhì)中，它的形狀一般呈網(wǎng)狀。在不同的生理情況下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)轭w粒狀、桿狀或其他形狀。在電鏡下，高爾基體是一些緊密地重疊在一起的囊狀結(jié)構(gòu)。有些膜緊密地折疊成片層狀的扁平囊，有些扁平囊的末端膨大成大小不等的泡狀或囊泡狀結(jié)構(gòu)。
在有的電鏡照片上，可以看到這些膜是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連通的，還可以觀察到若干跡象，表明這些小囊泡可以連接于扁平囊，而成為扁平囊的一部分，扁平囊也可以在其末端部分脫落而形成小囊泡。另外，扁平囊也可以在囊腔中積累物質(zhì)，逐漸膨大而形成大囊泡?？梢?，組成高爾基體的小囊泡、層狀扁平囊和大囊泡三部分并不是固定的結(jié)構(gòu)，而是相互有關(guān)系的，它們是高爾基體功能活動不同階段的形態(tài)表現(xiàn)。
高爾基體在細(xì)胞內(nèi)的位置和分布情況，與它在不同細(xì)胞內(nèi)的功能有關(guān)。高爾基體的大小和在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量，因細(xì)胞的類別和生理狀況不同而有所不同。
高爾基體的主要功能有三方面。一是與分泌有關(guān)。早期根據(jù)光鏡的觀察，已有人提出高爾基體與細(xì)胞的分泌活動有關(guān)。后來，運用電鏡、細(xì)胞化學(xué)及放射自顯影技術(shù)更進(jìn)一步證實和發(fā)展了這個觀點。高爾基體在分泌活動中所起的作用，主要是將粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運來的蛋白質(zhì)類的物質(zhì)，進(jìn)行加工(如濃縮或離析)、儲存和運輸，最后形成分泌泡。當(dāng)形成的分泌泡自高爾基囊泡上斷離時，分泌泡膜上帶有高爾基囊膜所含有的酶，還能不斷起作用，促使分泌顆粒不斷濃縮、成熟，最后排出細(xì)胞外。最典型的，如胰外分泌細(xì)胞中所形成的酶原顆粒。放射自顯影技術(shù)證明，高爾基體自身還能合成某些物質(zhì)，如多糖類。它還能使蛋白質(zhì)與糖或脂結(jié)合成糖蛋白或脂蛋白的形式。在某些細(xì)胞(如肝細(xì)胞)中，高爾基體還與脂蛋白的合成、分泌有關(guān)。二是與溶酶體的形成有關(guān)?，F(xiàn)在一般都認(rèn)為初級溶酶體的形成過程與分泌顆粒的形成類似，也起自高爾基體囊泡。初級溶酶體與分泌顆粒(主要指一些酶原顆粒)，從本質(zhì)上看具有同一性，因為溶酶體含多種酶(主要是各種水解酶)，都是蛋白質(zhì)；與酶原顆粒一樣，也參與分解代謝物的作用。不同處在于：酶原顆粒是排出細(xì)胞外發(fā)揮作用，而溶酶體內(nèi)的酶類主要在細(xì)胞內(nèi)起作用。三是高爾基體還有其他功能，如在某些原生動物中，高爾基體與調(diào)節(jié)細(xì)胞的液體平衡有關(guān)系。
【摘要】 目的?：探討牛膝多糖(AbP)及其硫酸酯和磷酸酯衍生物對糖尿病(DM)大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)和腎功能的影響。方法：以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠致DM模型，觀察AbP、牛膝多糖硫酸酯衍生物(S-AbP)和牛膝多糖磷酸酯衍生物(P-AbP)對DM大鼠血糖、胰島細(xì)胞形態(tài)和分泌的影響;測定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平，觀察其對DM大鼠腎功能的影響。結(jié)果：AbP及其兩種衍生物均可明顯降低DM大鼠的血糖濃度(P?
【關(guān)鍵詞】 牛膝;多糖;衍生物;糖尿病;胰島細(xì)胞;腎功能;大鼠
Abstract: ? Objective: To study the effects of Achyranthes bidentata polysaccharides (AbP) and the sulfated derivative (S-AbP) and the phosphorylated derivative?(P-AbP)?of AbP on the morphology of islet cells and renal function in diabetic rats. Methods:?Diabetes was induced by a single injection of streptozotocin， changes of fasting blood glucose and morphology and secretion of islet cells in diabetic rats treated respectively with S-AbP，P-AbP and AbP were observed，the renal function was also evaluated by examining serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN). Results:?Compared with diabetes group， the blood glucose significantly decreased in S-AbP， P-AbP and AbP treated group(P?
Key words: ?Achyranthes bidentata Blurne;Polysaccharides;derivative;diabetes;islet cells;renal function;rats
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組由胰島素分泌缺陷或生物學(xué)作用障礙引起的以高血糖為主要特征的常見內(nèi)分泌代謝疾病。DM并發(fā)癥累及多器官系統(tǒng)的功能損害。進(jìn)行性胰島β細(xì)胞毀損，胰島素分泌缺乏是1型DM的主要病理生理特征，也是其發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動因素[1]。我們以往的研究已經(jīng)證實牛膝多糖(Abp)衍生物對DM大鼠肝、腎氧化應(yīng)激損傷有明顯的保護(hù)作用，對DM大鼠的高血糖、高血脂狀態(tài)具有一定改善和控制作用[2-3]。本實驗擬通過觀察Abp及其衍生物對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、血清肌酐和尿素氮含量等的影響，旨在探討其對DM大鼠胰島β細(xì)胞、腎功能損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
1??材料和方法
1.1??實驗動物??清潔級(II級)雄性SD大鼠，體重200～250 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號sysxk(浙)2005-0061。
1.2??主要藥品與試劑??AbP中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所，純度：99.8%);牛膝多糖硫酸酯(S-AbP，本實驗室參考田庚元[4]的方法，采用氯磺酸-吡啶法自制，多糖酯含量91.3%，取代度2.39);牛膝多糖磷酸酯(P-AbP，本實驗室參考田庚元[5]的方法，以三氯氧磷為磷酸化試劑自制，多糖酯含量86.5%，取代度0.70);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由Sigma公司出品，臨用前以無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成pH 4.2、濃度為2.5 mg·mL-1的工作液;消渴丸，廣州中一藥業(yè)有限公司(批號為J00387);HE染液(南京建成生物工程公司);兔抗鼠胰島素抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);山羊抗兔IgG抗體，DAB顯色試劑盒(北京天來生物公司);其他均為國產(chǎn)分析純。
1.3??動物模型制備、分組與給藥??SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取出6只作為正常對照(NC)組，除NC組外，其余的大鼠禁食12 h后，按55 mg·kg-1劑量一次性腹腔注射新配制的STZ，NC組給予0.1 mol·L-1 pH 4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。注射后72 h，尾部采血測空腹12 h的血糖，把血糖值高于16.8 mmol·L-1并穩(wěn)定1周的大鼠定為DM大鼠。將DM大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只動物，即模型DM組、消渴丸(XK)組、S-AbP組、P-AbP組及AbP組。NC組和DM組按0.1 mL·kg-1灌胃蒸餾水，XK組按1.5 g·kg-1灌胃消渴丸，S-AbP組、P-AbP組和AbP組分別按100 mg·kg-1灌胃S-AbP、P-AbP和AbP，每天灌胃1次，并且每隔2 d 稱體重1次，及時調(diào)整灌胃劑量。各組大鼠在室溫24～26 ℃下用同種飼料飼養(yǎng)，持續(xù)灌胃30 d后處死。
1.4??血糖、血清肌酐(SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量測定??大鼠禁食12 h后乙醚麻醉，眼眶后靜脈叢取血， 37 ℃溫浴10 min，以3?000 r/min速度離心10 min，取上清500μL，用日立7170全自動生化分析儀測定血糖、Scr和BUN水平。
1.5??胰腺組織HE染色??大鼠處死后立即取胰腺組織，放入新鮮配制并4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋制成石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。
1.6??胰腺組織免疫組化染色??免疫組化染色按SP試劑盒說明進(jìn)行操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，拍照。
1.7??統(tǒng)計學(xué)處理方法??以one-way ANOVA分析各組別之間的差異，各組間均數(shù)比較采用LSD檢驗。
2??結(jié)果
2.1??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠血糖水平的影響
??藥物治療前，DM組和各治療組間大鼠血糖濃度差異無顯著性，但均明顯高于NC組(均P?
2.2??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠Scr和BUN水平的影響??DM組大鼠Scr和BUN水平顯著高于NC組(P
2.3??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠胰島病理形態(tài)學(xué)的影響??見圖2，NC組大鼠胰島數(shù)目較多，呈現(xiàn)圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)狀，邊界清楚;胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形。DM組大鼠胰島數(shù)目稀少，胰島內(nèi)細(xì)胞排列不規(guī)則，邊界不清，胰島細(xì)胞核大小、形態(tài)不規(guī)則，部分胰島細(xì)胞發(fā)生空泡變性，也有淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。XK組和S-AbP組與DM組相比病變較輕，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增多，分布規(guī)則，胞漿飽滿，細(xì)胞核大小形態(tài)接近正常。P-AbP組和AbP組的胰島病變也較DM組輕。
2.4??S-AbP和P-AbP對DM大鼠胰島素表達(dá)的影響??胰島β細(xì)胞分泌的胰島素與其特異性的抗體結(jié)合后呈現(xiàn)棕褐色顆粒。NC組大鼠胰島內(nèi)充滿β細(xì)胞(胰島素陽性反應(yīng)細(xì)胞)，分泌顆粒豐富(棕褐色)，著色深。DM組大鼠胰島內(nèi)β細(xì)胞分布稀少，分泌顆粒較少，著色較淺。XK組和S-AbP組大鼠與DM組大鼠相比胰島素陽性反應(yīng)細(xì)胞較多，分泌顆粒較多，著色較深。P-AbP組和AbP組大鼠也有少數(shù)著色較深的分泌顆粒，見圖3。
3??討論
STZ是一種廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤的性能和致DM的作用，對實驗動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用，引起胰島素分泌絕對不足。STZ誘導(dǎo)的DM與人類1型DM的臨床表現(xiàn)、過程及胰島的改變等方面有許多相似之處。此模型具有制造方法簡便、藥物毒性較低、胰島β細(xì)胞損傷特異性高等優(yōu)點，是目前國內(nèi)外研究1型DM較理想的動物模型[6]。在本實驗中，大鼠經(jīng)用STZ腹腔注射后，血糖顯著升高，而胰腺病理學(xué)檢查顯示胰島數(shù)目減少，β細(xì)胞分泌顆粒減少，即胰島素合成分泌不足，從而誘發(fā)大鼠致1型DM。
AbP是從牛膝中提取的一種小分子水溶性多糖，具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)和活血化瘀等功能[7]。多糖衍生化是提高多糖活性的重要手段，一些本來無活性的多糖經(jīng)過衍生化后活性可大大改善。硫酸酯化和磷酸酯化是多糖的重要衍生化方法[8]。本實驗顯示，DM大鼠予以S-AbP、P-AbP和AbP治療后，血糖明顯降低，胰島β細(xì)胞數(shù)量增加，增生肥大的β細(xì)胞容積基本恢復(fù)正常，胰島素分泌功能顯著改善，表明S-AbP、P-AbP和AbP對DM大鼠胰島β細(xì)胞具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。本實驗同時發(fā)現(xiàn)S-AbP、P-AbP對DM大鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于AbP，這可能是AbP經(jīng)硫酸化或磷酸化修飾后，構(gòu)象改變，抗氧化、清除自由基等能力增加，顯示出更高的生物學(xué)活性或新的生理活性[2，9]，因而對胰島β細(xì)胞起到更好的保護(hù)作用。
DM大鼠血糖長期居高不下，會導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)腎小球增生肥大、基底膜增厚等病理改變，繼而影響腎功能。我們的研究表明S-AbP、P-AbP和AbP能在一定程度上減輕DM大鼠腎臟的病變程度(已于另文報道)。Scr和BUN是反映機(jī)體腎功能的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)DM大鼠Scr、BUN含量升高，P-AbP、AbP使DM大鼠Scr含量明顯降低，S-AbP使DM大鼠Scr、BUN水平都顯著降低，表明S-AbP和P-AbP、AbP對DM大鼠腎功能有一定的保護(hù)作用。
總之，本實驗從生化、胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度證實，S-AbP、P-AbP和AbP可改善DM大鼠高血糖狀態(tài)，保護(hù)腎功能，對胰島β細(xì)胞功能具有一定的保護(hù)作用，且S-AbP和P-AbP的作用優(yōu)于AbP。AbP具有抗氧化[2]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[10]、降血脂[3]等作用，而且較之靈芝多糖、香菇多糖等，AbP具有相對分子質(zhì)量小，水溶性好，藥源廣泛，使用方便(既可口服，又可注射)等優(yōu)點。因此，作為一類新型的降糖藥物，AbP尤其是其衍生物，具有廣闊的醫(yī)藥開發(fā)和應(yīng)用前景。
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本研究從[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]種植體周圍炎患者脫落種植體周圍骨組織中獲取成骨細(xì)胞，通過對炎癥與正常組織來源的成骨細(xì)胞進(jìn)行對比，探討種植體周圍炎對成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為種植修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 臨床樣本收集
種植體周圍炎的骨組織樣本來自中國總醫(yī)院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區(qū)且因種植體周圍炎出現(xiàn)種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來源的樣本來自中國總醫(yī)院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術(shù)患者，夾取舌側(cè)骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質(zhì)疏松癥等全身系統(tǒng)性疾病。本研究已經(jīng)中國總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且每例患者均簽署了知情同意書。
1.2 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化
PBS反復(fù)沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國），吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，待鋪皿80%進(jìn)行傳代。采用反復(fù)貼壁法[3]對細(xì)胞進(jìn)行純化。
1.3 堿性磷酸酶鑒定染色
將第3代分離純化后的成骨細(xì)胞以每孔1×104個的密度接種于24孔板，細(xì)胞達(dá)70%時，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復(fù)沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國）染色1 h。PBS反復(fù)沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)觀察及照相。
1.4 MTT法檢測成骨細(xì)胞的增殖能力
取對數(shù)生長期第3代細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細(xì)胞混懸液，調(diào)整密度為2×104個·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%
CO2[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光度值，實驗重復(fù)3次。
1.6 Western blot法檢測成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)
取第3代細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞用0.01 mol·L-1 PBS反復(fù)沖洗3遍，裂解細(xì)胞提取蛋白。取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國）（1︰1 000稀釋）和β-actin（1︰2 000稀釋），37 ℃孵育2 h，洗膜后，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國）（1︰4 000稀釋）孵育50 min，化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物，X線片顯影并定影，所有雜交信號經(jīng)成像分析儀系統(tǒng)測定條帶密度進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白的表達(dá)水平。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，獨立樣本t檢驗進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2 結(jié)果
2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化
種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞與正常組織來源的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)過程中狀態(tài)基本相同，10～14 d時從組織塊中爬出，形狀多為不規(guī)則形和三角形（圖1）。反復(fù)貼壁法純化成骨細(xì)胞貼壁后，2種來源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯差異，細(xì)胞均呈長梭形和多邊形，胞核可見多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。
2.2 堿性磷酸酶鑒定染色
細(xì)胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進(jìn)行檢測，可見藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來源細(xì)胞都表現(xiàn)出了堿性磷酸酶陽性，但正常組織來源的成骨細(xì)胞比種植體周圍炎來源成骨細(xì)胞內(nèi)可見更多染色顆粒。
2.3 2種來源的成骨細(xì)胞增殖能力的比較
MTT檢測結(jié)果（圖4）表明，正常組織來源與種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞都表現(xiàn)出了一定的體外擴(kuò)增能力，從第4天起2種來源細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。
2.5 2種來源的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較
Western blot檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d時，與正常組織來源的成骨細(xì)胞相比，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)降低，相對灰度值分析表明種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)水平約為正常組織來源的1/3（P<0.05）（圖6）。
3 討論
骨結(jié)合是牙種植手術(shù)的基礎(chǔ)。種植體與頜骨骨性結(jié)合面的形成與種植區(qū)的骨密度密切相關(guān)，骨密度越高，種植體與骨的結(jié)合率就越高[4]。種植體周圍炎正是在炎性微環(huán)境下，破壞了種植體與頜骨的骨結(jié)合，從而使種植體周圍支撐骨組織的功能喪失。成骨細(xì)胞在骨組織的修復(fù)和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]的主要細(xì)胞；因此，研究炎癥組織來源的成骨細(xì)胞很有意義。
本研究從種植體周圍炎種植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來源的成骨細(xì)胞，通過比較炎癥組織來源的成骨細(xì)胞和正常組織來源的成骨細(xì)胞的增殖能力以及相關(guān)骨組織修復(fù)基因的表達(dá)等生物學(xué)功能變化，探討炎性微環(huán)境對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
本實驗選用的成骨細(xì)胞均為第4代以內(nèi)的細(xì)胞，結(jié)果表明，炎癥組織來源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)后仍然具有一定的炎癥組織來源特異性。炎性細(xì)胞因子和種植體周圍炎致病菌的毒力因子會導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖能力顯著 下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)上并沒有表現(xiàn)出和正常組織來源的成骨細(xì)胞有明顯差異，但是在細(xì)胞增殖活力方面表現(xiàn)出了不同，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力整體低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。筆者認(rèn)為這是由于種植體周圍炎的炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo)，Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨組織的形成與重建過程中具有重要的作用[5]。炎性因子會影響Runx2的表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細(xì)胞分化成骨的重要基質(zhì)。研究[8]表明，種植體周圍炎的齦溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的Runx2和Col Ⅰ表達(dá)水平相比正常組織來源顯著下降，表明炎性微環(huán)境可影響成骨細(xì)胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達(dá)，這與Liu等[9]對干細(xì)胞的研究結(jié)果一致。
OCN與成骨細(xì)胞的礦化緊密相關(guān)，在一定程度上反應(yīng)了成骨細(xì)胞礦化的能力。學(xué)者[10]研究證實炎性微環(huán)境會降低[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達(dá)。本研究中，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN mRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致OCN蛋白水平也明顯降低?？梢娧仔晕h(huán)境抑制了成骨細(xì)胞礦化的能力。
炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受多方面調(diào)控，通過對比種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞和正常組織來源的成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能變化，可以確定炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是種植體周圍骨組織吸收的重要原因。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。
[關(guān)鍵詞]涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生 出入境管理工作 情報信息應(yīng)用能力 培養(yǎng)
伴隨著21世紀(jì)的到來， 世界范圍內(nèi)的科技革命突飛猛進(jìn)，數(shù)字化、智能化、網(wǎng)絡(luò)化等各種高新技術(shù)正向各個領(lǐng)域全方位滲透，警務(wù)方式也發(fā)生了革命性的變革，情報主導(dǎo)警務(wù)模式便成為當(dāng)前警務(wù)工作方式的主流。面對新型警務(wù)模式的建立，出入境管理部門必須主動適應(yīng)信息化社會的客觀要求，牢固樹立情報信息主導(dǎo)警務(wù)的觀念，切實增強(qiáng)出入境情報信息管理工作的針對性、有效性和預(yù)見性，推動出入境管理工作的全面和可持續(xù)發(fā)展。
一、加強(qiáng)涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)是為從事出入境管理工作墊定基礎(chǔ)。
（一）情報信息的應(yīng)用是出入境管理工作中的中端業(yè)務(wù)。
出入境管理部門作為一個涉外的、公開實施行政管理的部門， 主要是代表國家行使出入境管理職能， 不僅其自身業(yè)務(wù)的發(fā)展和提高離不開情報信息工作， 而且出入境管理部門還必須通過開展和加強(qiáng)情報信息工作，為建設(shè)公安信息化隊伍的整體工作服務(wù)。
（二）當(dāng)前出入境管理工作中情報信息應(yīng)用存在的問題。
1.出入境管理部門中公安民警的情報素質(zhì)相對較低具體表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）公安民警對出入境情報信息收集工作的認(rèn)識不夠， 在思想上還停留在單純以上報數(shù)量或獲取名次來衡量工作成績的傾向。（2）公安民警發(fā)現(xiàn)情報信息的敏感性不足，缺乏一名合格情報人員對情報信息所應(yīng)具有的職業(yè)敏感性。（3）公安民警收集情報信息的方法不得當(dāng)，對于情報信息的收集僅僅停留在直接獲取的層次，而對于間接收集情報信息的方法沒有做深入研究。
2.情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發(fā)揮。由于出入境管理部門中公安民警的情報素質(zhì)相對較低，對于公安情報信息系統(tǒng)的使用也不夠熟悉，一些建立得較為完善的信息系統(tǒng)，大多還停留在資料庫、數(shù)據(jù)庫的利用上，只發(fā)揮出有限的查詢功能，系統(tǒng)更高級的功能沒有得到發(fā)揮。這是致使情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發(fā)揮的主要原因。
3.出入境管理部門的公安民警在情報信息應(yīng)用方面的培訓(xùn)與實戰(zhàn)脫軌。出入境管理部門十分重視情報信息在其工作的重要作用，也經(jīng)常給內(nèi)部民警做業(yè)務(wù)培訓(xùn)。問題的關(guān)鍵是培訓(xùn)的內(nèi)容針對性不強(qiáng)，只是圍繞公安系統(tǒng)的大框架介紹情報信息的應(yīng)用，而沒有針對出入境管理工作中情報信息的應(yīng)用展開分析。導(dǎo)致公安民警所學(xué)知識與實戰(zhàn)脫軌，無法適應(yīng)實戰(zhàn)。
（三）加強(qiáng)涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息應(yīng)用能力的重要性。
當(dāng)前，出入境管理部門情報信息工作面臨的嚴(yán)峻形勢要求公安院校必須加強(qiáng)涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息工作能力的培養(yǎng)。作為涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生，我們肩負(fù)著維護(hù)祖國出入境管理秩序，保衛(wèi)祖國邊防安寧的神圣使命，因此必須要樹立正確的世界觀、價值觀、人生觀，努力提升自己，以適應(yīng)社會的需求，適應(yīng)出入境管理工作對出入境人才的需求。
二、涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)目標(biāo)。
（一）培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的積極興趣。
1.大力給學(xué)生貫徹情報主導(dǎo)警務(wù)的理念，讓學(xué)生認(rèn)識到情報信息應(yīng)用能力在出入境管理工作中的重要意義。教師在平日的教學(xué)中要讓學(xué)生認(rèn)識到情報信息是出入境管理工作的生命線，是科學(xué)決策的基礎(chǔ)，及時、準(zhǔn)確、適用的情報信息是出入境管理部門克敵制勝的法寶。當(dāng)情報主導(dǎo)警務(wù)的理念深入學(xué)生心中時，他們學(xué)習(xí)情報信息的興趣也會有很大的提高?！傲己玫拈_端是成功的一半”，只要激發(fā)出了學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的興趣，就能將他們培養(yǎng)出他們在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力。
2.促成學(xué)生研究情報信息知識的主觀能動性，讓學(xué)生形成主動在出入境管理工作中應(yīng)用情報信息的潛意識。學(xué)習(xí)情報信息知識的特點在于易學(xué)難精，所以對學(xué)生而言，只有學(xué)習(xí)情報信息知識的一腔熱血是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，最重要的是要有研究情報信息知識的主觀能動性。自覺地在情報信息知識的領(lǐng)域內(nèi)鉆研，領(lǐng)會情報信息知識的精華所在，自如的將情報信息應(yīng)用到出入境管理中去，形成一種在出入境管理工作中應(yīng)用情報信息的潛意識，提升自身在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的能力。
（二）培養(yǎng)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息的收集能力和判斷能力。
1.提醒學(xué)生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學(xué)生養(yǎng)成積極捕捉情報信息的好習(xí)慣?！胺彩骂A(yù)則立，不預(yù)則廢”，情報信息工作能力的形成是一個漫長而艱巨的過程，在這期間需要大量的情報信息的積累。因此教師在平日的學(xué)習(xí)生活中要提醒學(xué)生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學(xué)生養(yǎng)成積極捕捉情報信息的好習(xí)慣?！笆朗露疵鹘閷W(xué)問，人情練達(dá)介文章”，通過大量信息情報的積累，學(xué)生的思維無意識就會向情報信息方面靠攏。當(dāng)這種思維過程已經(jīng)成為習(xí)慣性模式嵌入意識深處，變?yōu)橐环N自覺心理傾向，情報意識也就形成了。
2.增強(qiáng)學(xué)生對出入境情報信息的職業(yè)敏感性，讓學(xué)生形成敏銳的情報判斷能力。出入境情報信息工作做為一項特殊行業(yè)的工作，欲將其做好，必須增強(qiáng)對情報信息的職業(yè)敏感性，形成敏銳的情報判斷能力。對于情報判斷能力的提高需從兩個方面著手：一是對相關(guān)信息進(jìn)行初步的分析研判， 防止大量信息垃圾的污染， 提高情報的收集效率。二是對情報進(jìn)行系統(tǒng)的分析， 各方面信息綜合考慮， 相互比對、印證， 這樣能夠保證情報分析研判工作的準(zhǔn)確性， 實現(xiàn)情報的優(yōu)勢。
（三）培養(yǎng)學(xué)生出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的創(chuàng)造性。
1.豐富學(xué)生在出入境情報信息方面的知識，讓學(xué)生在出入境情報信息方面的思維得到擴(kuò)展。情報信息方面的知識不是一成不變的，是不斷更新的，其更新周期的不斷縮短就要求我們不斷更新知識。教師應(yīng)著力豐富學(xué)生在出入境情報信息方面的知識，增強(qiáng)學(xué)生出入境情報信息知識需求意識，提高他們的檢索技能，通過大量的出入境情報信息知識的積累，使學(xué)生在出入境情報信息方面的思維得到擴(kuò)展。
2.肯定學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域內(nèi)的想象力，讓學(xué)生在出入境情報信息應(yīng)用之中添加自己的創(chuàng)新之處。出入境情報領(lǐng)域是一個沒有邊界的領(lǐng)域，在沒有邊界的學(xué)科研究中就不能否認(rèn)學(xué)生獨到的見解之處。就出入境情報信息應(yīng)用而言，學(xué)生往往會想出很多新的方法將情報信息更好的銜接在出入境管理工作之中。此時，作為教師就應(yīng)該肯定學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域的想象力，讓其在以后的工作中發(fā)揮更大的創(chuàng)造力。
三、涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)途徑。
（一）加強(qiáng)涉外警務(wù)系教師情報主導(dǎo)警務(wù)的理念，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的興趣。
出入境情報信息工作是一項實踐性很強(qiáng)的工作，學(xué)生欲想了解其中的技巧性，僅僅通過聆聽缺乏實戰(zhàn)經(jīng)驗的教師講述理論知識是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此公安院校必須邀請長期從事出入境情報信息工作的民警來學(xué)校給教師和學(xué)生授課、作講座，介紹出入境管理中情報信息工作的經(jīng)驗與做法。同時選派涉外警務(wù)系的教師到出入境管理部門掛職鍛煉，增強(qiáng)出入境情報信息工作實踐經(jīng)驗，提升教師隊伍的素質(zhì)和授課水平。教師要積極關(guān)注國內(nèi)外有關(guān)出入境情報信息工作的最新動態(tài)，了解出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的最新方法，及時傳遞給學(xué)生，活躍學(xué)生思維，激發(fā)他們學(xué)習(xí)情報信息的興趣，培養(yǎng)他們出入境情報信息應(yīng)用意識，提高他們在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的能力。
（二）加強(qiáng)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息實際應(yīng)用能力，讓其在實踐工作之中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。
出入境信息工作極具實踐性的特性要求學(xué)生必須具有實際應(yīng)用能力。教育與實踐相結(jié)合是提高情報信息應(yīng)用能力的根本方法，因此校方應(yīng)該加強(qiáng)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息實際應(yīng)用能力，盡可能多的讓學(xué)生到出入境管理部門進(jìn)行實習(xí)工作，更多的接觸出入境管理工作中情報信息方面的知識。學(xué)生要積極利用見習(xí)和實習(xí)的機(jī)會，把在學(xué)校所學(xué)的有關(guān)出入境情報信息工作的理論運用到實際出入境管理工作中，在實踐工作中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。
（三）拓寬學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域之中的知識面，努力開發(fā)其在出入境情報信息應(yīng)用之中的創(chuàng)新潛能。
出入境情報信息領(lǐng)域所涉及的知識十分廣闊，并且知識的更新周期也日漸縮短。因此教師應(yīng)該盡可能多收集國內(nèi)外有關(guān)情報信息的書籍，開拓情報信息工作的思路。同時應(yīng)該通過講座、培訓(xùn)的形式給學(xué)生講授與出入境情報信息有關(guān)聯(lián)的學(xué)科的基礎(chǔ)知識，特別要重點講授手工檢索、國際聯(lián)機(jī)檢索等知識，使學(xué)生盡早掌握常用的中外檢索工具的使用方法，接觸到出入境情報信息領(lǐng)域內(nèi)的更多更新的知識。學(xué)生通過研究出入境情報信息方面的知識，得出自己在出入境情報信息工作上的獨到見解，努力開發(fā)自身在出入境情報信息應(yīng)用中的創(chuàng)新潛能。
四、結(jié)語
總而言之， 在情報主導(dǎo)出入境管理工作的體系下公安教育也應(yīng)與時俱進(jìn)， 注重涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)，使學(xué)生畢業(yè)后適應(yīng)情報主導(dǎo)出入境管理體系下的工作要求，推進(jìn)出入境管理工作信息化的建設(shè)。
參考文獻(xiàn)：
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【摘要】 目的：嘗試構(gòu)建基于脂肪干細(xì)胞、I型膠原凝膠以及PLGAβTCP支架的新型仿生骨組織工程復(fù)合體，并對其生物學(xué)性能進(jìn)行研究. 方法：取3 mo齡日本大耳白兔皮下脂肪，獲得脂肪干細(xì)胞，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)分化鑒定后使用I型膠原凝膠將其懸浮并與三維多孔支架PLGAβTCP復(fù)合，從而構(gòu)建成脂肪干細(xì)胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP骨組織工程復(fù)合體，體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2 wk，實驗以脂肪干細(xì)胞/PLGAβTCP材料復(fù)合體作為對照. 掃描電鏡觀察復(fù)合情況，并對脂肪干細(xì)胞的增殖以及成骨誘導(dǎo)分化情況進(jìn)行檢測. 結(jié)果：I型膠原凝膠將rADSCs均勻懸浮于材料孔隙中，堿性磷酸酶活性以及細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度檢測顯示I型膠原凝膠能顯著促進(jìn)rADSCs的成骨分化. 結(jié)論：脂肪干細(xì)胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP復(fù)合體的構(gòu)建成功為骨組織工程復(fù)合體的設(shè)計提供了一條新的思路.
【關(guān)鍵詞】 脂肪干細(xì)胞； I型膠原凝膠； PLGAβTCP支架； 骨組織工程
【Abstract】 AIM: To fabricate a novel bone tissue engineering construct using collagen I gel to suspend adiposederived stem cells (ADSCs) into a porous PLGAβTCP scaffold (rADSCsCOL/PLGAβTCP) and explore its potentiality for bone tissue engineering. METHODS: ADSCs were prepared by collagenase I digestion of subcutaneous fat from the suprascapular site of Japanese white rabbit. Firstly， the osteogenic differentiation of rabbit ADSCs (rADSCs) was identified by von Kossa staining after in vitro culture for 4 weeks under osteogenic medium. Then the rADSCsCOL/PLGAβTCP composite was fabricated using collagen I gel to suspend rADSCs into PLGAβTCP scaffold and cultured under osteogenic medium for 2 weeks. Meanwhile， the single combination of rADSCs and PLGAβTCP scaffold was also prepared as control. Morphological observations were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Cell proliferation， alkaline phosphatase activity and calcium deposit were also determined to fully evaluate the osteogenic differentiation of rADSCs in both composites. RESULTS: By presuspended in collagen I gel， the rADSCs were evenly distributed in the pores of the PLGAβTCP scaffold. Furthermore， collagen I gel remarkably promoted the osteogenic differentiation of rADSCs in PLGAβTCP scaffold. CONCLUSION: The successful fabrication of rADSCsCOL/PLGAβTCP composite casts a new light on the construction of bone tissue engineering composites.
【Keywords】 adiposederived stem cells; collagen I gel; PLGAβTCP; bone tissue engineering
0 引言
生物支架材料是骨組織工程研究中的一個重要環(huán)節(jié)［1］. 目前常用的生物材料例如高分子聚合物、生物陶瓷等，在與種子細(xì)胞復(fù)合過程中僅僅能夠起到機(jī)械性支架作用，而缺乏生物活性，在與種子細(xì)胞復(fù)合以后，難以與其形成良好互動，對其進(jìn)一步的增殖、成骨分化施加積極影響. 而I型膠原作為骨組織中主要的有機(jī)成分，在骨形成過程以及維持正常骨結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了重要作用［2］. 為此，我們從仿生學(xué)角度考慮，初步嘗試?yán)肐型膠原凝膠懸浮脂肪干細(xì)胞（adiposederived stem cells， ADSCs）與三維多孔支架PLGAβTCP復(fù)合構(gòu)建一種新型仿生骨組織工程復(fù)合體，并對其生物學(xué)性能進(jìn)行研究，以探討將其應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 3 mo齡成年日本大耳白兔，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供；DMEM培養(yǎng)基、地塞米松、抗壞血酸、β甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶、磷酸對硝基苯酚（PNPP）、對硝基苯酚（PNP）均購自SIGMA公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；堿性磷酸酶檢測試劑盒購自上海仁寶試劑公司；細(xì)胞外鈣定量檢測試劑盒（Calcium C kit， WAKO Pure Chemical Industries）.
1.2 方法
1.2.1 兔ADSCs（rabbit ADSCs， rADSCs）的原代培養(yǎng) 3 mo齡成年日本大耳白兔，耳緣靜脈注射空氣處死. 常規(guī)備皮，消毒，取其頸背部皮下脂肪. 分離肉眼可見的筋膜、血管，無菌PBS沖洗3遍，眼科剪將組織剪成1～2 mm3組織塊，置于1.5 g/L Ⅰ型膠原酶中于37℃消化1 h. 100目篩網(wǎng)過濾后900 r/min離心10 min，用普通培養(yǎng)液（含100 mL/L胎牛血清的DMEM）重新懸浮、接種. 待細(xì)胞達(dá)90％匯合時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.2 rADSCs的成骨誘導(dǎo)分化鑒定 采用第3代rADSCs，以105個/孔接種于6孔板，待其完全貼壁后于普通培養(yǎng)液中加入10-7 mol/L地塞米松、抗壞血酸50 mg/L和10 mmol/L β甘油磷酸鈉進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，4 wk后采用馮庫薩（von Kossa）鈣染色法檢測誘導(dǎo)分化情況.
1.2.3 PLGAβTCP支架的制備 由清華大學(xué)激光快速成型中心將聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）［polylactide (50%)coglycolide (50%)］與β磷酸三鈣（βTCP）按照7∶3，W/W的比例經(jīng)快速成型技術(shù)低溫沉積工藝制成［3］，具有良好的孔隙率（>90 %）以及孔徑（300 ～350 μm）.
1.2.4 I型膠原凝膠溶液的制備 將I型膠原用100 mL/L，V/V醋酸溶解并定容至50 mg/L，然后將其以10∶1∶1的比例與10×的DMEM及胎牛血清混合，最后使用1 mol/L NaOH調(diào)整溶液pH至7.4. Co60消毒滅菌，置于4℃?zhèn)溆?
1.2.5 rADSCsI型膠原凝膠/PLGAβTCP骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建（rADSCsCOL/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其達(dá)100％匯合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心，于冰浴條件下使用100 μL I型膠原凝膠溶液以2×109個/L的密度懸浮細(xì)胞并均勻滴加于PLGAβTCP支架材料孔隙中，37℃作用0.5 h以使膠原凝膠溶液凝結(jié). 最后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液于37℃ 50 mL/L CO2條件下進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng). 同時設(shè)立無細(xì)胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP復(fù)合體作為對照（COL/PLGAβTCP）.
1.2.6 rADSCs/PLGAβTCP骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建（rADSCs/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其達(dá)100％匯合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心，以2×109個/ L的密度懸浮細(xì)胞. 取100 μL細(xì)胞懸液均勻接種于預(yù)處理的PLGAβTCP支架中. 于37℃ 50 mL/L CO2條件下共培養(yǎng)4 h，使細(xì)胞與材料充分復(fù)合. 最后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng). 同時設(shè)立空白PLGAβTCP支架材料作為對照.
1.2.7 材料中細(xì)胞增殖檢測 于接種后4 h和第1，3，7，10，14 d進(jìn)行細(xì)胞增殖測定. rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組：將培養(yǎng)液吸除后加入20 g/L的I型膠原酶于37℃條件下作用45 min以徹底分解I型膠原纖維，等量培養(yǎng)液中和后將細(xì)胞懸液吸出并于1200 r/min離心10 min. rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組：將培養(yǎng)液吸出后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，等量培養(yǎng)液中和，900 r/min離心9 min. 最后將細(xì)胞團(tuán)塊重新懸浮于培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并計算初始細(xì)胞接種密度（復(fù)合細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量）（每組每個時間點共有4例標(biāo)本）.
1.2.8 堿性磷酸酶活性檢測 采用PNPP法. 步驟：于誘導(dǎo)培養(yǎng)第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體細(xì)胞（實驗方法同1.2.7）. 將兩組細(xì)胞經(jīng)超聲裂解后，加入PNPP于37℃反應(yīng)30 min，0.1 mol/L NaOH中止反應(yīng). 于405 nm處讀取A值. 參照總蛋白定量以及預(yù)先繪制的PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線，將堿性磷酸酶活性單位定義為每分鐘每微克總蛋白中所含PNP納摩爾數(shù)（nmol PNP/μg protein/min）（每組每個時間點共有4例標(biāo)本）.
1.2.9 細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度檢測 采用OCPC法. 于誘導(dǎo)培養(yǎng)第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP以及rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體細(xì)胞（方法同1.2.7），加入0.5 mol/L HCl于常溫下過夜，將細(xì)胞外不溶性鈣鹽分解成可溶性鈣離子，實驗操作按照Calcium C Kit說明書進(jìn)行. 鈣離子濃度以μg/105個細(xì)胞表示（每組每個時間點共有4例標(biāo)本）.
1.2.10 形態(tài)學(xué)觀察 在誘導(dǎo)培養(yǎng)2 wk后，將各組復(fù)合體取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察. 實驗步驟：無菌PBS沖洗3遍，2.5 g/L戊二醛固定，逐級梯度酒精脫水，臨界點干燥. 經(jīng)表面噴金后置于鏡下觀察.
統(tǒng)計學(xué)處理： 所有計數(shù)資料均采用x±s表示，采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行配對t檢驗， P
2 結(jié)果
2.1 rADSCs的體外培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)分化鑒定 于體外培養(yǎng)條件下，原代培養(yǎng)rADSCs呈成纖維細(xì)胞樣，傳代后細(xì)胞形態(tài)變化不大，仍呈梭形、三角形，增殖能力旺盛. 連續(xù)培養(yǎng)至第15代仍保持良好的細(xì)胞形態(tài)與增殖能力（圖1A）. 換用成骨誘導(dǎo)液干預(yù)4 wk后經(jīng)von Kossa染色可見細(xì)胞及其周圍附著的鈣鹽與硝酸銀發(fā)生置換反應(yīng)而被染成黑色，說明此時細(xì)胞外基質(zhì)礦化，成骨分化基本完成（圖1B）.
A：原代培養(yǎng)rADSCs 相差 ×100；
B：von Kossa染色 相差 ×200.
圖1 體外培養(yǎng)兔ADSCs細(xì)胞（略）
2.2 材料中的細(xì)胞增殖情況 rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組的初始細(xì)胞接種密度為(97.20±2.30)%，而rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組僅為(36.50±3.80)%，前者顯著高于后者（n=4，P
2.3 堿性磷酸酶活性定量檢測 誘導(dǎo)培養(yǎng)1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組堿性磷酸酶活性為(0.27±0.02) nmol PNP/μg protein/min， 而rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組為(0.14±0.02) nmol PNP/μg protein/min，前者顯著高于后者；誘導(dǎo)培養(yǎng)2 wk后rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組堿性磷酸酶活性則高達(dá)(0.85±0.27) nmol PNP/μg protein/min，顯著高于rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組(0.51±0.14) nmol PNP/μg protein/min，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（n= 4， P
2.4 細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度檢測 誘導(dǎo)培養(yǎng)1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度［(23.69±3.50) μg/105個細(xì)胞］與rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組［(20.90±1.68) μg/105個細(xì)胞］差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n= 4， P>0.05）；而2 wk后前者［(71.88±2.89) μg/105個細(xì)胞］則顯著高于后者［(48.10±2.77) μg/105個細(xì)胞］（n=4， P
2.5 形態(tài)學(xué)觀察 掃描電鏡顯示，PLGAβTCP支架材料為規(guī)則的相互交通的多孔狀三維立體結(jié)構(gòu)（圖2A），而對于無細(xì)胞COL/PLGAβTCP復(fù)合體組，可以看到I型膠原纖維均勻分布于材料表面及孔隙中（圖2B）. 在rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組中，rADSCs僅貼附于材料表面，孔隙中沒有細(xì)胞長入(圖2C). 然而在rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組中，材料孔隙被懸浮于膠原凝膠中的rADSCs所完全充填(圖2D). 復(fù)合細(xì)胞共培養(yǎng)2 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組中的rADSCs在材料孔隙中均呈成纖維細(xì)胞樣生長(圖2E，F(xiàn)).
A: PLGAβTCP支架材料（：材料的小梁， ：材料的孔隙） ×60；B: COL/PLGAβTCP復(fù)合體 ×70；C: rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體 ×50；D: rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體 ×50；E: 為C圖白框的放大，rADSCs貼附于材料表面呈復(fù)層生長（: rADSCs） ×300；F: 為D圖白框的放大，rADSCs填滿材料的孔隙（: I型膠原凝膠經(jīng)掃描電鏡樣品處理程序處理后所形成的膠原顆粒， : rADSCs） ×200.
圖2 掃描電鏡觀察（略）
3 討論
在骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建過程中，三維多孔支架材料所具有的孔隙率以及孔徑大小具有重要意義. Karageorgiou等［4］報道的當(dāng)支架材料具有良好的孔隙率以及孔徑大于300 μm時，在體內(nèi)能夠明顯促進(jìn)新生骨組織形成以及新生血管長入，從而能夠在骨缺損修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用. 然而，良好的孔隙率以及孔徑往往會導(dǎo)致種子細(xì)胞在與材料復(fù)合時的大量丟失. 本研究采用具有良好的骨缺損修復(fù)能力的PLGAβTCP 作為支架材料［3，5］. 實驗結(jié)果顯示直接將rADSCs滴加于PLGAβTCP材料時，僅有一少部分細(xì)胞成功與材料復(fù)合，大部分細(xì)胞由于材料的孔隙率而丟失. 因此，具有良好的孔隙率以及孔徑的支架材料雖然具有良好的骨傳導(dǎo)性，但是由于其表面積相對有限，采用傳統(tǒng)直接滴加細(xì)胞的接種方式并不能夠促成細(xì)胞在材料孔隙中的均勻分布.
為了解決這個問題，在本實驗中I型膠原凝膠被用來實現(xiàn)脂肪干細(xì)胞與材料的均質(zhì)復(fù)合. I型膠原凝膠作為水凝膠類支架的一種，其所具有的半固體、半液態(tài)的特點使其不僅能夠相對容易的實現(xiàn)細(xì)胞的均勻分布，而且能夠通過物理性捕獲效應(yīng)將大量細(xì)胞限制于其中，一方面解決了細(xì)胞與材料的復(fù)合問題，另一方面也解決了在接種過程中細(xì)胞的丟失問題. 此外，作為正常骨組織結(jié)構(gòu)中主要的有機(jī)成分， I型膠原能夠調(diào)控細(xì)胞黏附［6］，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［7］、分化并能夠引導(dǎo)骨組織再生［8］. 因此，在本實驗中我們使用PLGAβTCP多孔支架、rADSCs以及I型膠原凝膠來構(gòu)建了一種新型仿生骨組織工程復(fù)合體. 實驗結(jié)果顯示I型膠原凝膠能夠顯著促進(jìn)復(fù)合體中rADSCs的堿性磷酸酶活性以及細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度（rADSCsCOL/PLGAβTCP復(fù)合體組＞rADSCs/PLGAβTCP復(fù)合體組，P
綜上所述，我們通過將rADSCs懸浮于I膠原凝膠后再與PLGAβTCP支架復(fù)合構(gòu)建了一種新型仿生骨組織工程復(fù)合體（rADSCsCOL/PLGAβTCP），與傳統(tǒng)直接滴加細(xì)胞接種方式所構(gòu)建的復(fù)合體相比（rADSCs/PLGAβTCP），本研究采用的構(gòu)建方法材料孔隙中的rADSCs分布均勻且密度高，進(jìn)一步體外成骨誘導(dǎo)分化相關(guān)檢測顯示I膠原凝膠能夠顯著促進(jìn)rADSCs在材料中的成骨分化，為骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建提供了新的思路.
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1.高中生物15個核心概念
這些概念從小到大的排列順序是：脫氧核糖；脫氧核苷酸；基因；DNA；染色質(zhì)；真核細(xì)胞；細(xì)胞，屬于微觀方面。組織；器官；系統(tǒng)；個體；群落；種群；生態(tài)系統(tǒng)；生物圈，屬于宏觀方面。現(xiàn)做如下說明。
1.1微觀方面
1.1.1脫氧核糖：一種單糖，由C、H、O三種元素組成，是組成脫氧核苷酸的成分。
結(jié)構(gòu)式
1.1.2脫氧核苷酸：是組成DNA的基本單位，由C、H、O、N、P五種元素組成，每一個脫氧核苷酸分子有一份子的脫氧核糖、一份子含氮堿基和一份子磷酸組成，脫氧核糖核苷酸的堿基有：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。根據(jù)所含堿基的不同，分為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸四種。脫氧核糖核酸（DNA）是由四種脫氧核苷酸通過化學(xué)鍵組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，就是通常意義上的DNA。其結(jié)構(gòu)式如下：
1.1.3基因：是具有遺傳效應(yīng)的DNA的片段，其基本組成單位是四種脫氧核苷酸，一個DNA上有許多基因。編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的遺傳信息的基本單位，是染色體或基因組的一段DNA序列，包括編碼區(qū)（外顯子）、編碼區(qū)前后對于基因表達(dá)具有調(diào)控功能的序列和單個編碼序列間的間隔序列（內(nèi)含子）。
1.1.4DNA：主要由4種脫氧核糖核苷酸按一定的順序，以3′，5′―磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸，是生物遺傳信息的載體。主要存在于細(xì)胞核中，少數(shù)存在于細(xì)胞質(zhì)中，是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。一個DNA上有許多基因，DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合成為染色質(zhì)或染色體。它們的組成和排列不同，顯示不同的生物功能，如編碼功能、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控功能等。排列的變異可能產(chǎn)生一系列疾病。
1.1.5染色質(zhì)：由DNA和蛋白質(zhì)組成，存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，易被堿性染料染成深色的物質(zhì)。染色質(zhì)的基本化學(xué)成分為脫氧核糖核酸白，它是由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復(fù)合物。
1.1.6真核細(xì)胞：具有核膜包裹的成型細(xì)胞核的細(xì)胞，細(xì)胞核中含染色質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等多種細(xì)胞器。真核細(xì)胞能進(jìn)行有絲分裂，還能進(jìn)行原生質(zhì)流動和變形運動。在植物細(xì)胞中光合作用和呼吸作用分別在葉綠體和線粒體中進(jìn)行。除細(xì)菌和藍(lán)藻植物的細(xì)胞以外，所有的動物細(xì)胞和植物細(xì)胞都屬于真核細(xì)胞，由真核細(xì)胞構(gòu)成的生物稱為真核生物。
1.1.7細(xì)胞：是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩種。細(xì)胞是生命活動的基本單位。已知除病毒之外的所有生物均由細(xì)胞所組成，就是病毒生命活動也必須在細(xì)胞中才能體現(xiàn)。一般來說，細(xì)菌等絕大部分微生物及原生動物由一個細(xì)胞組成，即單細(xì)胞生物；高等植物與高等動物則是多細(xì)胞生物。世界上現(xiàn)存最大的細(xì)胞為鴕鳥的卵子。
1.2宏觀方面
1.2.1組織：由形態(tài)相似、結(jié)構(gòu)、功能相同的細(xì)胞聯(lián)合在一起的細(xì)胞群，是細(xì)胞分化的結(jié)果。受精卵分裂產(chǎn)生的細(xì)胞開始在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上是相同的，以后經(jīng)過細(xì)胞的分化，逐漸形成各種不同的形態(tài)，具有不同的功能。它們進(jìn)而形成不同的細(xì)胞群，就是組織。所以說，組織是細(xì)胞分化的結(jié)果。動物和人的組織有四大類：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織和神經(jīng)組織。
1.2.2器官：由不同的組織按照一定的次序結(jié)合在一起而構(gòu)成的能行使一定功能的結(jié)構(gòu)單位。如動物的心臟、肺、肝、腎等，植物的花、果實、種子、根、莖、葉等。器官是由多種組織構(gòu)成器官是生物體中自己具有一定功能，承擔(dān)生物體一定的工作，是生物結(jié)構(gòu)層次中比組織高一級的層次，器官由各種組織構(gòu)成。植物的器官比較簡單，最高等的被子植物有根、莖、葉、花、果實、種子六大器官，而其他植物并不是都有這六大器官的。裸子植物有根、莖、葉、花、果實；蕨類植物有根、莖、葉。
1.2.3系統(tǒng)：能夠共同完成一種或幾種生理功能的多個器官，按照一定的次序組合而構(gòu)成系統(tǒng)。如動物的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等。
1.2.4個體：若干個器官和系統(tǒng)協(xié)同完成復(fù)雜生命活動的單個生物體為一個個體。單細(xì)胞生物的個體就是由一個細(xì)胞構(gòu)成的生物體。個體能夠進(jìn)行新陳代謝，實現(xiàn)自我更新，在新陳代謝的基礎(chǔ)上，表現(xiàn)出生長、發(fā)育、衰老、死亡，等等。
1.2.5種群：是指在一定時間內(nèi)占據(jù)一定空間的同種生物的所有個體。種群中的個體并不是機(jī)械地集合在一起，而是彼此可以，并通過繁殖將各自的基因傳給后代。它是進(jìn)化的基本單位，同一種群的所有生物共用一個基因庫。
1.2.6群落：把在一定生活環(huán)境中的所有生物種群的總和叫做生物群落，簡稱群落。組成群落的各種生物種群不是任意地拼湊在一起的，而有規(guī)律組合在一起才能形成一個穩(wěn)定的群落。它們之間有各種直接和間接的關(guān)系。在群落中，一個種群的興衰、變化都會對其他種群產(chǎn)生各種各樣的影響。
1.2.7生態(tài)系統(tǒng)：在一點自然區(qū)域中，生物群落與它的無機(jī)環(huán)境相互作用而形成的統(tǒng)一整體。它是由生物群落與無機(jī)環(huán)境構(gòu)成的，生態(tài)系統(tǒng)的范圍可大可小，相互交錯，最大的生態(tài)系統(tǒng)是生物圈，最為復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)是熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)。它由無機(jī)環(huán)境因素和生物因素組成，無機(jī)因素包括陽光、水、空氣、溫度、無機(jī)鹽等，生物因素由生產(chǎn)者（綠色植物）、消費者（草食動物和肉食動物）、分解者（腐生微生物）三部分組成。它既有垂直結(jié)構(gòu)又具有水平結(jié)構(gòu)。
1.2.8生物圈：生物圈是指地球上凡是出現(xiàn)并感受到生命活動影響的地區(qū)，是地表生物體包括微生物及其自下而上環(huán)境的總稱，是地球特有的圈層。它也是人類誕生和生存的空間。生物圈是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)。它包括大氣圈的下層、巖石圈的上層、整個水圈和土壤圈全部。
2.細(xì)胞是核心概念的橋梁,是宏觀和微觀的分界線
在這些概念中，屬于生命系統(tǒng)層次的基本概念是：細(xì)胞組織器官系統(tǒng)個體種群群落生態(tài)系統(tǒng)生物圈，其中細(xì)胞是微觀系統(tǒng)和宏觀系統(tǒng)的分界線。
關(guān)鍵詞生物正交化學(xué)，代謝工程，生物標(biāo)記，活體示蹤，藥物傳遞
生物正交化學(xué)（bioorthogonal chemistry）反應(yīng)是指在不干擾機(jī)體正常生物過程的情況下，可以在生物體內(nèi)進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng).這種化學(xué)反應(yīng)即使在復(fù)雜的生理條件下也具有優(yōu)良的選擇性，反應(yīng)過程簡單快速并且不會受體內(nèi)其他成分的影響，不會產(chǎn)生毒副產(chǎn)物，在生物醫(yī)學(xué)的研究中有著廣泛的應(yīng)用前景［1-2］.該反應(yīng)通過生物、化學(xué)反應(yīng)將目的報告基團(tuán)修飾到靶標(biāo)物上，隨后與攜帶配對基團(tuán)的標(biāo)記物發(fā)生化學(xué)連接反應(yīng)，從而實現(xiàn)標(biāo)記物對靶標(biāo)物的穩(wěn)定偶聯(lián)［3-4］.目前廣泛使用的生物正交反應(yīng)包括：金屬催化或光催化的生物正交反應(yīng)以及無需催化的生物正交反應(yīng).銅催化的疊氮和末端炔基之間的環(huán)加成反應(yīng)（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）是生命科學(xué)研究中常用的生物正交反應(yīng)，但是銅離子對生物體具有毒性，不適宜廣泛應(yīng)用.在此基礎(chǔ)上，Bertozzi等［5］于2004年開發(fā)了一種新型的無銅生物正交化學(xué)反應(yīng)（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC），該反應(yīng)避免了銅作為催化劑所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，成功地將生物正交反應(yīng)應(yīng)用于活細(xì)胞（圖1）.常用的生物正交化學(xué)基團(tuán)主要包括疊氮（N3）基團(tuán)、二苯并環(huán)辛基（dibenzocyclooctyne，DBCO）、雙環(huán)［6.1.0］壬炔（bicyclo［6.1.0］nonyne，BCN）和雙苯并八元環(huán)炔（dibenzocyclooctyne，DIBO）等.其中，N3基團(tuán)與炔基（DBCO，BCN）之間具有高度的反應(yīng)活性.N3基團(tuán)尺寸小，引入到活體系統(tǒng)中僅產(chǎn)生微小的結(jié)構(gòu)擾動，不影響生物分子的功能，并且天然的生物體內(nèi)不存在N3分子，因而不會與體內(nèi)的生物分子反應(yīng)，是一種理想的生物正交功能基團(tuán)［6-7］.
為了在體內(nèi)實現(xiàn)高效、特異的生物正交標(biāo)記，首先需要將理想的正交反應(yīng)基團(tuán)（如疊氮基團(tuán)）選擇性地引入到細(xì)胞或生物體的目標(biāo)生物分子上，隨后利用配對基團(tuán)修飾的標(biāo)記物對目標(biāo)生物分子進(jìn)行選擇性連接.因此，如何安全、無損地將生物正交基團(tuán)引入生物靶標(biāo)物中仍然是一個亟待解決的問題.近年來，代謝工程（metabolic engineering）作為一種無損、高效的活體修飾技術(shù)，可利用生物體固有的代謝合成途徑將功能基團(tuán)引入到活體系統(tǒng)中［8-11］.這是由于生物體在代謝過程中需要利用氨基酸、糖類或脂類等生物成分，通過將功能基團(tuán)修飾到糖類或脂類等生物分子中，便可通過固有的生物合成途徑在體外或體內(nèi)直接將功能基團(tuán)修飾到活細(xì)胞或活體生物中.基于代謝工程與生物正交化學(xué)的標(biāo)記技術(shù)，通過在活細(xì)胞或整個生物體中引入特定的生物正交化學(xué)基團(tuán)，隨后與配對基團(tuán)修飾的探針或納米藥物通過生物正交化學(xué)反應(yīng)連接，可以實現(xiàn)對目標(biāo)分子或生物體的特定標(biāo)記、細(xì)胞或病原微生物的成像示蹤、藥物的靶向遞送等（圖2）［6］.該技術(shù)通過細(xì)胞內(nèi)源性代謝過程而快速形成穩(wěn)定的共價連接，而且不受外源化學(xué)反應(yīng)干擾，因此具有無損、高效、穩(wěn)定、特異的優(yōu)點，并成為研究者關(guān)注的焦點.本文主要從以下幾個方面闡述生物正交化學(xué)在活體系統(tǒng)中應(yīng)用的最新研究進(jìn)展.
1生物正交化學(xué)在活體標(biāo)記與示蹤中的應(yīng)用
為了了解細(xì)胞或病原微生物等活體系統(tǒng)的生物學(xué)機(jī)制，對目標(biāo)生物分子在體內(nèi)進(jìn)行特定的標(biāo)記和追蹤是重要的研究手段.目前常用較為成熟的生物標(biāo)記技術(shù)，包括熒光蛋白基因編碼和熒光染料抗體偶聯(lián).綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因編碼標(biāo)記常用于蛋白質(zhì)的功能研究，分析活細(xì)胞和整個機(jī)體中的蛋白質(zhì)表達(dá)和定位，但是此類較大的基因編碼標(biāo)記物會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生擾動，從而影響相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能，而且這種基因標(biāo)記方法不適用于細(xì)胞中的聚糖、脂類、核酸等生物分子［1，7，12］.另外，雖然熒光染料抗體偶聯(lián)物也已廣泛應(yīng)用于跟蹤活細(xì)胞和整個機(jī)體的生物分子，適用于多種生物分子的成像，但是這些偶聯(lián)試劑的大尺寸和物理性質(zhì)阻礙了它們在活體系統(tǒng)中結(jié)合抗原，從而限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用［1，6］.因此，尋找一個能在活體內(nèi)廣泛適用且對生物體幾乎沒有影響的標(biāo)記技術(shù)，對于活體生物的功能研究具有極其重要意義.近年來，科學(xué)家們發(fā)展了基于代謝工程的生物正交化學(xué)修飾策略，該策略利用生物自身的生物合成和代謝機(jī)制，將獨特的功能基團(tuán)（生物正交化學(xué)功能基團(tuán)）整合到目標(biāo)生物分子中，從而實現(xiàn)在復(fù)雜的生物體內(nèi)對目標(biāo)分子的標(biāo)記和研究.
1.1細(xì)胞的生物正交代謝標(biāo)記
在活細(xì)胞中，蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)都可以被生物正交基團(tuán)修飾［7，13］.通過化學(xué)合成的方法將生物正交基團(tuán)連接到代謝類似物上，利用生物的代謝合成過程將生物正交基團(tuán)引入細(xì)胞，隨后用配對基團(tuán)修飾的反應(yīng)探針連接，可以實現(xiàn)對目標(biāo)生物分子的標(biāo)記或成像，進(jìn)而分析細(xì)胞或目標(biāo)生物分子的定位和重要功能.
科學(xué)家研究證實了代謝標(biāo)記的生物正交基團(tuán)能有效標(biāo)記細(xì)胞，Bertozzi的團(tuán)隊［14］利用糖代謝工程與生物正交反應(yīng)，分析了活斑馬魚的胚胎發(fā)育過程中多種糖類結(jié)構(gòu).該團(tuán)隊在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，在不同的細(xì)胞發(fā)展階段加入環(huán)辛炔功能化的唾液酸，使其作為一種糖類衍生物可以被細(xì)胞利用并將功能基團(tuán)引入細(xì)胞表面的糖蛋白上，隨后與配對基團(tuán)修飾的熒光探針通過生物正交反應(yīng)連接，可視化地研究斑馬魚胚胎發(fā)展過程中糖類表達(dá)的動力學(xué)和定位.Rong等［15］使用N修飾的糖類似物在體內(nèi)代謝標(biāo)記大鼠的心臟聚糖，N3可與DBCO修飾的熒光探針反應(yīng)，在活體心臟中可視化監(jiān)控心肌細(xì)胞表面糖蛋白.此外，將心臟分離裂解后，與炔烴修飾的生物素反應(yīng)，用鏈霉親和素珠富集后，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定.這一研究在大鼠中實現(xiàn)了心臟聚糖的體內(nèi)代謝標(biāo)記和成像，有利于探索心臟糖基在病理生理過程中的生物合成和功能應(yīng)用.Lee等［16］開發(fā)了一種簡單可控的干細(xì)胞成像方法，首先利用疊氮化的代謝前體Ac4ManNAz，通過糖代謝在干細(xì)胞表面引入N3基團(tuán)作為外源性化學(xué)受體，隨后制備攜帶BCN基團(tuán)的納米顆粒BCN-CNPs，將Cy5.5熒光染料、氧化鐵納米粒子和金納米粒子分別偶聯(lián)或包封在BCN-CNPs上，用于光學(xué)、磁共振和計算機(jī)斷層掃描成像.這些可成像的納米粒子通過生物正交反應(yīng)結(jié)合在干細(xì)胞表面上的化學(xué)受體，實現(xiàn)對干細(xì)胞的體內(nèi)追蹤.
1.2病原微生物的生物正交標(biāo)記與示蹤
細(xì)菌和病毒等病原微生物嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，探索病原微生物在活體內(nèi)的侵襲行為和相關(guān)機(jī)制顯得尤為重要.利用代謝工程和生物正交反應(yīng)，可以實現(xiàn)對病原微生物的活體示蹤，有利于研究其致病機(jī)制.細(xì)菌多糖具有獨特的結(jié)構(gòu)，多與發(fā)病機(jī)制有關(guān)，是廣泛研究的靶點.通過代謝工程和生物正交化學(xué)對細(xì)菌多糖進(jìn)行標(biāo)記，能夠可視化地研究細(xì)菌的體內(nèi)侵襲行為［17］.Swarts等［18］設(shè)計了一系列含有N3基團(tuán)的海藻糖類似物，分枝桿菌通過代謝合成途徑利用人工合成的海藻糖合成自身的細(xì)胞壁糖脂，從而在細(xì)菌表面引入N3基團(tuán).隨后與炔基功能化的熒光探針通過生物正交反應(yīng)連接，用于后續(xù)糖脂分布、轉(zhuǎn)運和動力學(xué)成像以及代謝產(chǎn)物的分析和發(fā)現(xiàn).Geva-Zatorsky等［19］利用糖代謝工程和生物正交化學(xué)對腸道的各種共生厭氧菌進(jìn)行標(biāo)記，可視化地研究了厭氧微生物在小鼠體內(nèi)的分布和定位，以及微生物與宿主的相互作用.
病毒感染導(dǎo)致的疾病是對人類健康的一大威脅，了解病毒入侵的機(jī)制有助于我們更好地預(yù)防和治療病毒感染導(dǎo)致的疾病［20-21］.通常使用基因工程技術(shù)使病毒表達(dá)熒光受體或者使用熒光試劑化學(xué)偶聯(lián)病毒，以實現(xiàn)對病毒的成像和跟蹤［20，22］.然而，這些標(biāo)記技術(shù)容易影響病毒的侵襲能力，無法準(zhǔn)確再現(xiàn)病毒在機(jī)體內(nèi)的感染過程，不利于病毒入侵機(jī)制的研究.由于病毒的蛋白質(zhì)和核酸等分子均可被標(biāo)記，將代謝工程與生物正交化學(xué)結(jié)合，可實現(xiàn)對病毒的無損代謝修飾，最終實現(xiàn)對病毒的實時跟蹤或標(biāo)記［23-24］.
病毒外部結(jié)構(gòu)的組成部分，如病毒衣殼、囊膜等，是由糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)構(gòu)成的，這些成分主要來源于宿主細(xì)胞.通過細(xì)胞的代謝過程，可在病毒進(jìn)行復(fù)制與組裝時將攜帶功能基團(tuán)的代謝衍生物嵌入到病毒的衣殼、囊膜等結(jié)構(gòu)中.Pan等［25］提出的利用生物正交和脂類代謝標(biāo)記技術(shù)追蹤病毒的策略，減少了化學(xué)標(biāo)記對病毒的干擾，有效研究了病毒的體內(nèi)感染過程.通過將疊氮化物修飾的脂類代謝標(biāo)記到H5N1p病毒包膜上，利用DBCO修飾的近紅外熒光探針通過生物正交反應(yīng)偶聯(lián)小鼠肺部的病毒，實現(xiàn)了體內(nèi)的病毒成像和追蹤.
2生物正交化學(xué)在靶向傳遞中的應(yīng)用
通過代謝工程，生物正交化學(xué)基團(tuán)可以被修飾到細(xì)胞或病原微生物的表面，以此構(gòu)建人工靶點.將其應(yīng)用于藥物的靶向傳遞時，能顯著提高藥物的生物利用率，從而降低藥物的毒副作用.在納米材料的發(fā)展過程中，生物配體例如抗體、多肽、適配體等通常被連接到納米材料表面用于增加與特定細(xì)胞系的結(jié)合，從而實現(xiàn)藥物的靶向遞送［26-28］.然而，這種傳統(tǒng)的靶向修飾策略會增加納米顆粒制備的復(fù)雜性，給生物應(yīng)用帶來潛在的風(fēng)險［29-30］.近年來，基于代謝工程的生物正交化學(xué)標(biāo)記作為一種有效的靶向修飾策略，被廣泛應(yīng)用于藥物的靶向設(shè)計.
2.1抗腫瘤藥物的靶向遞送
傳統(tǒng)的靶向配體修飾策略已經(jīng)被證明具有較好的腫瘤靶向效果，例如抗體偶聯(lián)藥物.然而，基于抗體的藥物傳遞系統(tǒng)存在一定的局限性，包括腫瘤的異質(zhì)性以及由于長期化療或長期藥物暴露導(dǎo)致的癌細(xì)胞中抗原的下調(diào)，嚴(yán)重影響了抗腫瘤藥物的靶向應(yīng)用［8，13］.代謝工程可以在包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞表面，人工引入生物正交功能基團(tuán)（如N3基團(tuán)）作為化學(xué)受體，并且不受限于細(xì)胞的表型，這些人工化學(xué)受體可大量表達(dá)，用于生物正交標(biāo)記、靶向識別和藥物遞送［8，31-32］.
目前，生物正交化學(xué)反應(yīng)已被應(yīng)用于成像劑和抗腫瘤藥物的組織靶向遞送，具有很好的體內(nèi)示蹤和腫瘤靶向效果［33-34］.在癌癥治療中，體內(nèi)可視化的成像劑遞送以及針對腫瘤組織的特異性藥物的遞送是非常有必要的.可視化有利于體內(nèi)的腫瘤診斷，而高效特異的藥物傳遞可以提高藥物的治療效果，減少不良反應(yīng).基于糖代謝的生物正交化學(xué)使得生物體內(nèi)靶向的藥物傳遞以及腫瘤的診斷治療獲得進(jìn)一步的改善.Lee等［31］通過兩步體內(nèi)腫瘤靶向策略實現(xiàn)了對腫瘤的高效特異性靶向.第一步通過小鼠尾靜脈注射包載了疊氮化糖Ac4ManNAz的納米顆粒，通過高滲透長滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）使其在腫瘤部位累積，并且通過細(xì)胞固有的生物代謝作用在腫瘤細(xì)胞引入N3基團(tuán).第二步尾靜脈注射包載了Ce6的BCN修飾的納米顆粒，通過體內(nèi)生物正交反應(yīng)使含藥納米顆粒靶向富集在腫瘤部位，顯著提高了對腫瘤的治療效果.Du等［35］首先給小鼠尾靜脈注射裝載了疊氮化糖衍生物的納米膠束（Ac4ManNAz-LP），使其依靠EPR效應(yīng)累積在腫瘤部位并對腫瘤代謝修飾N3基團(tuán)，隨后將制備的DBCO修飾的光敏劑納米顆粒（DBCO-ZnPc-LP）注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果證明DBCO-ZnPc-LP通過生物正交反應(yīng)能很好的累積在腫瘤部位，產(chǎn)生高效的光熱/光聲協(xié)同抗腫瘤效果.此外，我們課題組構(gòu)建了一種雙靶向的仿生納米顆粒［36］，將N基團(tuán)引入到T細(xì)胞表面作為人工靶點，提取細(xì)胞膜包裹于納米顆粒表面，利用T細(xì)胞膜的免疫識別功能以及N3基團(tuán)與BCN基團(tuán)之間的生物正交反應(yīng)，實現(xiàn)了對腫瘤的高效靶向和光熱治療（圖3）.
2.2免疫治療中的靶向應(yīng)用
免疫治療是腫瘤治療的有效方法之一，生物正交化學(xué)反應(yīng)可用于免疫刺激物的傳遞，增強(qiáng)免疫治療抗腫瘤的效果.Zhang等［37］通過在磁性納米簇的表面包裹被N3工程化的白細(xì)胞膜，然后通過生物正交反應(yīng)在細(xì)胞膜表面修飾T細(xì)胞刺激物，設(shè)計了一種人工抗原呈遞細(xì)胞（aAPCs）.制備的aAPCs可以刺激抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）的擴(kuò)增，并且通過磁共振成像和磁控技術(shù)，可以直觀有效地引導(dǎo)CTL進(jìn)入腫瘤組織，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤治療效果.Mongis等［38］將不同的免疫刺激物與DBCO基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)，用疊氮化的糖預(yù)處理腫瘤細(xì)胞使其表達(dá)N3基團(tuán)，隨后通過生物正交化學(xué)反應(yīng)將免疫刺激物連接到腫瘤細(xì)胞表面，成功引入的免疫刺激物可以激活小鼠的抗腫瘤免疫作用，顯著抑制腫瘤的生長.
此外，生物正交化學(xué)在免疫治療中也發(fā)揮著很大的作用，具有很好的應(yīng)用前景.我們課題組基于生物正交糖代謝構(gòu)建了一類新型的非天然單糖類似物（Ac4ManN-BCN），并將其應(yīng)用于T細(xì)胞的免疫治療研究.該單糖類似物高效地將化學(xué)報告基團(tuán)BCN標(biāo)記于腫瘤細(xì)胞表面，形成一種腫瘤表面的人工靶點，構(gòu)建一種人工T細(xì)胞-腫瘤靶向策略.疊氮修飾后的T細(xì)胞（N3-T細(xì)胞）利用生物正交反應(yīng)快速地靶向BCN標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞（BCN-tumor細(xì)胞），并促進(jìn)T細(xì)胞的快速激活及其對腫瘤的識別殺傷作用［39］.同時，我們利用前期細(xì)胞糖代謝工程將化學(xué)報告基團(tuán)（-N3）嵌入T細(xì)胞膜中，構(gòu)建人源T細(xì)胞人工受體，病毒經(jīng)納米材料（PEI-DBCO）包裹后，病毒粒子表面的DBCO基團(tuán)與T細(xì)胞人工受體（-N3）發(fā)生高效、特異的生物正交反應(yīng)，促進(jìn)病毒與T細(xì)胞的相互作用與基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而構(gòu)建出安全、高效的CAR-T細(xì)胞，實現(xiàn)對腫瘤的免疫治療［40］（圖4）.
2.3抗菌藥物的靶向遞送
【關(guān)鍵詞】細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)；細(xì)胞膜功能；合作探究；小組合作
我今天說課的內(nèi)容是人教版必修一第三章第一節(jié)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。高中生物必修課本一共三冊書，必修一分子與細(xì)胞是其中的基礎(chǔ)，而必修一中細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，前面學(xué)習(xí)了構(gòu)成生物體的物質(zhì)基礎(chǔ)：元素和化合物，接下來又學(xué)習(xí)元素和化合物構(gòu)成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)細(xì)胞。只有這部分知識的熟練掌握才能更好地理解和學(xué)習(xí)后面的細(xì)胞的增殖，分化，衰老，癌變；必修二的減數(shù)分裂；必修三的興奮地傳遞和激素的功能特點。同時高一的學(xué)生剛剛進(jìn)入高中階段的學(xué)習(xí)對高中的學(xué)習(xí)方法和技巧沒有更多的深入，而且初三沒有學(xué)習(xí)生物學(xué)科，我在上課的過程中注意學(xué)生生物學(xué)科的學(xué)習(xí)方法和技巧的培養(yǎng)，培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)思維和生物學(xué)的學(xué)習(xí)方法，例如讓學(xué)生多參與實驗，設(shè)計實驗，體驗生物學(xué)科是實驗科學(xué)；為學(xué)生盡可能多地提供動腦動手的機(jī)會，培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)散思維、想象力，初步培養(yǎng)科研的思維。
一、課堂前教案分析
（一）教學(xué)目標(biāo)
知識目標(biāo)：了解細(xì)胞膜的成分、結(jié)構(gòu)和功能。能力目標(biāo)：進(jìn)行用哺乳動物紅細(xì)胞制備細(xì)胞膜的實驗；體驗制備細(xì)胞膜的方法；探討在建立生物膜模型的過程中，實驗技術(shù)的進(jìn)步所起的作用。情感態(tài)度目標(biāo)：認(rèn)同細(xì)胞膜作為系統(tǒng)的邊界對于細(xì)胞這個生命系統(tǒng)的重要意義；探討建立生物膜模型的過程如何體現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點。
（二）教學(xué)重點與難點
教學(xué)重點主要包括以下幾點：細(xì)胞膜的成分和功能；細(xì)胞膜對于細(xì)胞這個生命系統(tǒng)的重要意義。教學(xué)難點：用哺乳動物紅細(xì)胞制備細(xì)胞膜的方法。細(xì)胞膜對于細(xì)胞這個生命系統(tǒng)的重要意義。建立生物膜模型的過程如何體現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點。
（三）教學(xué)方法
教學(xué)方法有很多種，本次主要是運用以下的一些方法：引導(dǎo)探究，模型制作，小組合作，小先生講課，通過這些方法能很好地引導(dǎo)學(xué)生盡快地進(jìn)入課堂氛圍，而且能夠親自參與到課堂教學(xué)中，增加同學(xué)們的學(xué)習(xí)興趣。
二、課堂教學(xué)過程設(shè)計
通過做一個演示實驗：兩個燒杯分別裝涼水和開水，同學(xué)上來操作，分別放入等量的玫瑰花瓣，用玻璃棒攪拌，請同學(xué)們觀察有什么現(xiàn)象？得出什么結(jié)論？通過這個觀察到的現(xiàn)象從而引出細(xì)胞膜的功能，鍛煉和培養(yǎng)學(xué)生的觀察和分析的能力，此部分大約用時5—8分鐘。
細(xì)胞膜的這么重要的功能，與什么有關(guān)？究竟又怎樣的結(jié)構(gòu)決定的呢？首先要制備出真正的生物膜才能夠是由有說服力。此處是一個很重要的實驗，鑒于實驗材料和器材的顯示采用的方法是理論實驗，培養(yǎng)學(xué)生自己在腦中先預(yù)設(shè)實驗，用問題串的形式將該實驗需要的所有問題都引導(dǎo)出來。
我們選擇什么樣的材料來做這個實驗?zāi)?？（動物?xì)胞，植物細(xì)胞，細(xì)菌類細(xì)胞，哺乳動物的成熟的紅細(xì)胞）你為什么選擇這樣的實驗材料，依據(jù)是什么？
你選擇了哺乳動物的成熟的紅細(xì)胞，接下來你如何操作能夠制備細(xì)胞膜呢？為什么要這樣操作？
細(xì)胞破裂后，如何才能將細(xì)胞膜取出來呢？用到了其他學(xué)科的什么知識？
制備了細(xì)胞膜，究竟含有哪些化合物？我采用的方法是沿著科學(xué)史的步伐，根據(jù)曾經(jīng)的科學(xué)家們的實驗，看看同學(xué)的分析能力。
細(xì)胞膜的化學(xué)組成為：磷脂分子，蛋白質(zhì)分子，多糖分子。這些化合物用什么樣的方式結(jié)合起來，能夠滿足我們前面分析的細(xì)胞膜的功能？提供材料：塑料板，磷脂模型，蛋白質(zhì)模型，多糖模型。
分組：同學(xué)們六人一組，進(jìn)行拼圖實驗，看看你做的模型怎樣才能滿足細(xì)胞膜的功能。
在這個過程中，學(xué)生會存在這樣那樣的問題，你的設(shè)計，為什么這樣設(shè)計，有不同意見的同學(xué)起來反駁，你的反駁理由是什么？這樣設(shè)計對不對，為什么？應(yīng)該怎樣設(shè)計呢？邊設(shè)計邊訂正，到最后同學(xué)自己說服自己，制作出真正正確的磷脂雙分子層的流動鑲嵌模型。能夠讓學(xué)生充分理解為什么細(xì)胞膜要有這樣的結(jié)構(gòu)，同時還鍛煉了學(xué)生設(shè)計實驗的能力，科學(xué)辯證的思維能力。
課堂快結(jié)束的時候，讓同學(xué)起來總結(jié)一下這節(jié)課你學(xué)習(xí)了什么？知識方面的收獲還有其他的收獲嗎？為了滿足不同層次的學(xué)生的需求，采用分層次布置作業(yè)，基礎(chǔ)的部分+能力提高部分。有興趣的同學(xué)上網(wǎng)查資料，細(xì)胞膜上的甲胎蛋白與人體健康。
三、小結(jié)
高中生物教學(xué)方法多種多樣，本文旨在對學(xué)生生物學(xué)科的學(xué)習(xí)方法和技巧的培養(yǎng)，培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)思維和生物學(xué)的學(xué)習(xí)方法，為學(xué)生盡可能多的提供動腦動手的機(jī)會，培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)散思維、想象力，初步培養(yǎng)科研的思維。
【參考文獻(xiàn)】
［1］馮文琪.淺談如何在高中生物教學(xué)中培養(yǎng)學(xué)生的探究能力[J].新課程（中），2011（2）.
